燃煤型氟中毒大鼠诱导型一氧化氮合酶蛋白表达、血清睾酮与生精细胞凋亡的相关性研究.pdf

NJA 中华男科学杂志 National Journal of Andrology Zhonghua Nan Ke Xue Za Zhi 2014， 20 10 874 －880 http / /www． androl． cn 论著 Basic Ｒesearch 基础研究 燃煤型氟中毒大鼠诱导型一氧化氮合酶蛋白表达、 血清睾酮与生精细胞凋亡的相关性研究 肖跃海 1， 2，孙 发 1，田 源 1，石家齐1，单玉喜2， 谷江 1，唐开发1， 马洪贵1，孙 超 1，赵伊立1 1． 贵阳医学院附属医院泌尿外科，贵州 贵阳 550004; 2． 苏州大学第二附属医院泌尿外科，江苏 苏州 215004 【摘要】 目的研究燃煤型氟中毒大鼠睾丸组织诱导型一氧化氮合酶 iNOS 蛋白表达、 血清睾酮 T 与生精 细胞凋亡的相互关系， 探索燃煤型氟中毒对睾丸生殖功能损伤的机制。方法将 40 只雄性 SD 大鼠随机分为 4 组 对照组、 低氟组、 中氟组、 高氟组。各染毒组喂饲含不同比例的燃煤型氟中毒病区煤烘玉米的饲料， 建立雄性大 鼠燃煤型氟中毒模型。分别于染毒 4 和 6 个月后以股动脉放血法处死大鼠， 各时间点每组处死大鼠 5 只。采用 ＲIA 法测定大鼠血清 T 水平; 检测血清中超氧化物歧化酶 SOD 活力、 丙二醛 MDA 含量、 iNOS 活性; 原位缺口末 端标记 TUNEL 法检测大鼠睾丸生精细胞凋亡情况并计算凋亡指数 AI ; 免疫组织化学染色 SP 法观察 iNOS 蛋白 表达的变化。 结果 成功建立雄性大鼠氟中毒模型。大鼠血清 T 水平在4 和6 个月时低氟组［ 28．37 0．19nmol/L、 14．68 0．36nmol/L］ 、 中氟组［ 25． 85 0． 23nmol/L、 9． 08 0． 31nmol/L］ 、 高氟组［ 23． 63 0． 29nmol/L、 4． 89 0． 54nmol/L］ 较对照组［ 29．77 0．43nmol/L、 29． 97 0． 36nmol/L］ 均降低 P ＜0． 05或 P ＜0． 01 ， 且各染氟组间差异有统计学意义 P ＜0． 05 或 P ＜0． 01 。睾丸生精细胞 AI 在 4 和 6 个月时低氟组 8． 83 1． 64、 10．40 2．70 、 中氟组 17．24 3． 96、 22． 20 3． 96 、 高氟组 44． 21 7． 85、 49． 60 4． 77 较对照组 0． 46 0． 11、 0． 54 0． 11 升高 P 均 ＜0． 01 ， 且各染氟组间差异有统计学意义 P ＜0． 05 或 P ＜0． 01 。睾丸组织 iNOS 蛋白表 达的 OD 值在 4 和 6 个月时低氟组 0． 073 3 0． 008 5、 0． 108 4 0． 012 6 、 中氟组 0． 142 5 0． 027 2、 0． 207 7 0．020 4 、 高氟组 0． 527 5 0． 079 1、 0． 717 3 0． 065 6 较对照组 0． 001 3 0． 000 2、 0． 001 6 0． 000 1 增加 P ＜ 0．05 或 0． 01 ， 且各染氟组间差异有统计学意义 P ＜0． 05 或 P ＜0． 01 。iNOS 蛋白表达量与生精细胞 AI 呈正相 关 r 0． 962， P ＜0． 01 ; 血清 T 水平与生精细胞 AI 呈负相关 r －0． 744， P ＜0． 01 。结论血清 T 水平改变和 睾丸组织 iNOS 蛋白表达调控改变可能参与燃煤型氟中毒对睾丸生殖功能损害的过程。 【关键词】生精细胞;睾酮;诱导型一氧化氮合酶;燃煤型氟中毒;雄性大鼠;凋亡 中图分类号Ｒ698 ． 2;Ｒ363． 1 6 文献标志码Adoi 10． 13263/j． cnki． nja． 2014． 10． 002 ① Correlation of iNOS expression and serum testosterone level with the apoptosis of spermatogenic cells in rats following endemic fluorosis from coal burning XIAO Yue- hai1， 2，SUN Fa1，TIAN Yuan1，SHI Jia- qi1，SHAN Yu- xi2，GU Jiang1，TANG Kai- fa1， MA Hong- gui1，SUN Chao1，ZHAO Yi- li1 478 ①基金项目国家自然科学基金 81360097 ; 中国科学院 “西部之光” 基金项目［黔科合计西光 2011 4003］ ; 贵州省高层次人才基金 TZJF- 2011- 27 ; 贵州省科技厅基金 黔科合外 G 字 2012- 7015 作者简介肖跃海 1986- ， 男， 云南昭通市人， 博士研究生， 从事泌尿外科及男科学研究。Emailxiaoyuehai1221126． com 通讯作者孙发， Emailsfguizhou163． com;石家齐， Emailshijiaqigy aliyun． com 1． Department of Urology，The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College，Guiyang，Guizhou 550004，China; 2． Department of Urology，The Second Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou，Jiangsu 215004，China 【Abstract】 ObjectiveTo investigate the relationship of the expression of inducible nitric oxidase synthase iNOSand the lev- el of serum testosterone Twith the apoptosis of spermatogenic cells in the rat testis following endemic fluorosis from coal burning， and explore the mechanism of the damage to male reproduction induced by endemic fluorosis from coal burning．sForty male SD rats were randomly divided into four groups of equal numbernormal control，low fluorosis，moderate fluorosis，and high fluorosis． The model of fluorosis was established by feeding the rats with corn dried by burning coal from endemic fluorosis areas． After 4 and 6 months，the rats were sacrificed，the serum T levels measured by radio- immuno- assay，the activities of superoxide dismutase SOD and the expressions of malonaldehyde MDAand iNOS determined by biochemical s，and the apoptotic index of spermatogenic cells detected by terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP nick end labeling TUNEL ．ＲesultsThe rat model of fluo- rosis was successfully established． At 4 and 6 months，the serum T levels were 28． 37 0． 19and 14． 68 0． 36nmol/L in the low fluorosis group， 25． 85 0． 23and 9． 08 0． 31nmol/L in the moderate fluorosis group，and 23． 63 0． 29and 4． 89 0． 54nmol/L in the high fluorosis group，significantly lower than 29． 77 0． 43and 29． 97 0． 36nmol/L in the normal control P ＜0． 05 or P ＜0． 01and with significant differences among the three model groups P ＜0． 05 or P ＜0． 01 ;the apoptotic inds of spermatogenic cells were 8． 83 1． 64 and 10． 40 2． 70 in the low fluorosis group， 17． 24 3． 96 and 22． 20 3． 96 in the moderate fluorosis group，and 44． 21 7． 85 and 49． 60 4． 77 in the high fluorosis group，markedly higher than 0． 46 0． 11 and 0． 54 0． 11 in the control rats all P ＜0． 01and with significant differences among the three model groups P ＜0． 05 or P ＜0． 01 ;the optical densities of the iNOS expression were 0． 073 3 0． 008 5 and 0． 108 4 0． 012 6 in the low fluorosis group，0． 142 5 0． 027 2 and 0． 207 7 0． 020 4 in the moderate fluorosis group， and 0． 527 5 0． 079 1 and 0． 717 3 0． 065 6 in the high fluorosis group， remark- ably higher than 0． 001 3 0． 000 2 and 0． 001 6 0． 000 1 in the control P ＜ 0． 05 or P ＜ 0． 01and with significant differences among the model groups P ＜0． 05 or P ＜0． 01except between the moderate and high fluorosis groups． The apoptotic index of sper- matogenic cells was correlated positively with the expression of iNOS r 0． 962，P ＜0． 01 ，but negatively with the serum T level r －0． 744，P ＜0． 01 ．ConclusionChanges in the serum T level and iNOS expression in the rat testis may be involved in the damage to the reproductive function by coal burning- induced endemic fluorosis．Natl J Androl， 2014 10 874 －880 【Key words】spermatogenic cell;testosterone;inducible nitric oxidase synthase;endemic fluorosis from coal burning;male rat; apoptosis Supported by National Natural Science Foundation of China 81360097 ，“ Western Light“ Project of Chinese Academy of Sciences ［ 2011］ 4003 ， High- Level Talent Foundation of Guizhou Province TZJF- 2011- 27 ，and Science and Technology Department of Guizhou Province G- 2012- 7015 ． Correspondence toSUN Fa，emailsfguizhou163． com;SHI Jia- qi，emailshijiaqigy aliyun． com ＲeceivedMay 31， 2014;acceptedJuly 14， 2014 微量元素与精子的发生、 成熟、 运动等密切相 关 ［1- 2 ］。氟是人体必需的微量元素之一， 但是长期 摄入过量氟会对机体多个组织产生损害， 国内外大 量研究发现过量氟影响睾丸的生殖功能［3- 5 ］。氟中 毒分为饮水型、 饮茶型、 燃煤型氟中毒 3 种， 其中燃 煤型氟中毒是我国所独有的一种氟中毒， 是由于长 期以敞灶方式燃烧高氟煤烘烤粮食和辣椒、 燃煤取 暖等， 造成室内食物和空气遭受氟污染而导致的氟 中毒， 涉及 14 个省、 市及自治区， 主要分布于长江三 峡流域和西南地区， 人口众多 ［6- 8 ］。前期研究发现， 燃煤型氟中毒可导致睾丸组织结构发生变化、 生殖 激素水平紊乱、 睾丸氧化/抗氧化系统失衡、 生精细 胞凋亡率升高、 生精功能降低 ［6- 9 ］。但燃煤型氟中 毒对男性生殖系统损害机制尚不完全清楚， 针对性 的预防和治疗工作仍然是一个难点。国内外学者分 析认为氧化应激损伤［10 ］、 生殖激素水平紊乱 ［7 ］和生 精细胞凋亡在氟所致睾丸生殖功能损伤中起重要作 用， 且相互间可能有密切关系 ［3， 11- 12 ］， 但具体作用机 制尚不明确。 本实验在前期实验的基础上， 建立雄性大鼠燃 煤污染型氟中毒动物模型， 进一步研究燃煤型氟中 毒大鼠氧化应激损伤与生精细胞凋亡之间的关系， 以探讨燃煤型氟中毒对男性生殖功能损害的可能机 制， 为病区人群防护和治疗提供理论依据。 1材料与方法 1． 1主要试剂和仪器 125I 睾酮 T 放射免疫分析 药盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司， 超氧化 578中华男科学杂志2014 年 10 月第 20 卷 第 10 期Natl J Androl，Vol． 20，No． 10，October 2014 物歧化酶 SOD 测定试剂盒、 丙二醛 MDA 测定试 剂盒、 一氧化氮合酶 NOS 分型测定试剂盒购自南 京建成生物工程研究所， TUNEL 细胞凋亡检测试剂 盒购自美国 Ｒoche 公司， 兔抗 iNOS 抗体、 兔 SP 免疫 组织化学染色试剂盒、 DAB 显色试剂盒、 山羊抗兔 IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。721 分 光光度计 上海青华科技仪器有限公司 ， 显微图像 采集系统 BH- 2 型 日本 Olympus 公司 ， 图像分析 软件 Image- Pro Plus 6． 0 IPP6． 0 美国 Meadia Cy- bernetics 公司 。 1． 2模型制备选用清洁级雄性 SD 大鼠 40 只， 体重 90 ～110 g， 由贵阳医学院实验动物中心提供 ［ SCXK 渝 2007- 0005］ 。随机分为对照组、 低氟 组、 中氟组、 高氟组 4 组， 每组 10 只。对照组给予正 常饲料 实验动物中心提供， 正常饲料中平均含氟 量为 1． 3 mg/kg ; 各染氟组给予使用病区含氟的煤 烘玉米 为病区经煤火烘烤干燥、 储藏后蓄积有氟 的病区居民食用的玉米， 本实验中所使用的煤烘玉 米来自于燃煤型氟中毒病区之一贵州省六盘水市， 平均含氟量为 80 mg/kg 配制的饲料。低、 中、 高氟 组大鼠分别喂饲含 25、 50、 75 的病区煤烘玉米 配制而成的饲料， 含氟量分别为 20 mg/kg、 40 mg/kg、 60 mg/kg， 制作燃煤型氟中毒模型。大鼠自由饮 用自来水。分别于染毒 4 和 6 个月后分批处死 动物， 各时间点每组随机抽出 5 只股动脉放血法 处死。 1． 3检测指标 1． 3． 1观察氟斑牙发生情况判断是否成功建立 雄性大鼠氟中毒模型。 1． 3． 2血清 T 水平的测定股动脉放血法处死动 物， 采血管收集股动脉血， 离心后取上层血清， 放射 免疫法 严格按说明书操作 检测大鼠血清 T 水平。 1． 3． 3血清总 SOD、 MDA 含量、 iNOS 活性测定 严格按试剂盒说明书对血清 SOD、 MDA 含量、 诱导 型一氧化氮合酶 iNOS 活性进行测定。 1． 3． 4iNOS 蛋白表达量的检测取大鼠睾丸组 织， 石蜡包埋， 切片， 按免疫组化 SP 法检测 iNOS 蛋 白， 阴性对照以 PBS 代替一抗。具体步骤按试剂盒 说明书进行。判定标准 以细胞质着棕黄色颗粒者 为 iNOS 表达阳性。每个标本取5 张切片， 每张切片 400 倍镜下随机选取 5 个视野在同一光源、 相同亮 度、 饱和度、 对比度、 增益条件下拍照; 所得图片用图 像分析软件 IPP 6． 0 进行检测， 计算光密度值 opti- cal density，OD 。 1．3． 5TUNEL 法检测大鼠睾丸生精细胞凋亡率 取大鼠睾丸组织， 10 多聚甲醛固定， 石蜡包埋切 片， 常规脱蜡脱水， 按美国 Ｒoche 公司试剂盒的方法 TUNEL 操作， 阴性对照不加末端转化酶。判定标 准 凋亡细胞核呈棕黄色即为阳性细胞， 阴性细胞核 为蓝色。光镜下观察、 拍照、 计数凋亡指数 apoptot- ic index，AI 。AI 每张切片400 镜下随机取 20 个生精小管横断面， 计数凋亡细胞数量， 平均每个生 精小管横断面的凋亡细胞数即为生精细胞 AI。 1． 4统计学分析采用 SPSS 13． 0 统计软件， 数据 以 x s 表示， 多组间比较采用单因素方差分析， 组 间两两比较采用 SNK- q 检验， 等级资料比较用秩和 检验， P≤0． 05 为差异有统计学意义。 2结果 2．1氟斑牙对照组大鼠牙齿均正常， 各染氟组不 同程度出现氟斑牙， 提示成功建立雄性大鼠氟中毒 模型。 2． 2血清 T 水平4 和 6 个月时各染氟组大鼠血 清 T 水平较对照组降低 P ＜ 0． 01 ， 且各染氟组间 差异有统计学意义 P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01 ; 6 个月 时各染氟组的血清 T 水平较 4 个月时下降 P ＜ 0． 05或 P ＜0． 01 。见表 1。 2． 3血清总 SOD 活性4 和 6 个月时各染氟组大 鼠血清 SOD 活性较对照组降低 P ＜0． 01 ， 且各染 氟组间差异有统计学意义 P ＜ 0． 05 ; 6 个月时各 组 SOD 活性较 4 个月时下降， 但差异无统计学意义 P ＞0． 05 。见表 1。 2． 4血清 MDA 含量4 和 6 个月时各染氟组大鼠 血清 MDA 含量较对照组升高 P ＜0． 01 ， 高氟组较 中氟组差异无统计学意义， 余各染氟组间差异有统 计学意义 P ＜0． 05 ; 6 个月时各组 MDA 含量较 4 个月时稍增加， 但差异无统计学意义 P ＞ 0． 05 。 见表 1。 2． 5血清 iNOS 活性4 和 6 个月时各染氟组大鼠 血清 iNOS 活性较对照组升高 P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01 ， 高氟组较中氟组升高但差异无统计学意义， 余各染氟组间差异有统计学意义 P ＜ 0． 05 ; 6 个 月时各组 iNOS 活性较4 个月时稍增加， 但差异无统 计学意义 P ＞0． 05 。见表 2。 678中华男科学杂志2014 年 10 月第 20 卷 第 10 期Natl J Androl，Vol． 20，No． 10，October 2014 表 1各组大鼠 4 和 6 个月时血清 T、 SOD 和 MDA 含量比较 n 5， x s Table 1． Levels of serum testosterone T ，superoxide dismutase SOD ，and malonaldehyde MDAin different groups of rats after exposed to fluoride for 4 and 6 months n 5，x s Group T nmol/L 4 mo6 mo SOD U/ml 4 mo6 mo MDA nmol/ml 4 mo6 mo Control29．77 0．4329．97 0．36159．86 4．30157．81 2．205．26 0．385．40 0．47 Low fluorosis28．37 0．19*14．68 0．36＊▲148．67 4．65*144．95 6．41*6．52 0．57*7．29 0．61* Moderate fluorosis25．85 0．23＊△9．08 0．31＊ △△▲▲134．97 4．72＊△126．00 5．45＊△8．34 0．79＊△8．50 0．02＊△ High fluorosis23．63 0．29＊△4．89 0．54＊△△▲▲122．76 3．70＊△117．18 5．88＊△8．99 0．36＊△9．07 0．53＊△ 与对照组比较， * P ＜0． 01; 与低氟组比较， △P ＜0． 05， △△P ＜0． 01; 与中氟组比较， ﹟P ＜0． 05， ﹟﹟P ＜0． 01; 与染 毒 4 个月时比较， ▲P ＜0． 05， ▲▲P ＜0． 01 * P ＜0． 01 versus the control group;△P ＜0． 05，△△P ＜0． 01 versus the low fluorosis group;P ＜0． 05，P ＜0． 01 ver- sus the moderate fluorosis group;▲P ＜0． 05，▲▲P ＜0． 01 versus 4 months． 2． 6睾丸组织 iNOS 蛋白的表达iNOS 的阳性表 达位于细胞质， 呈棕黄色。各染氟组中见 iNOS 表 达于各级生精细胞、 支持细胞和间质细胞，其中精 原细胞和精母细胞中表达强烈。对照组睾丸生精细 胞、 支持细胞和间质细胞胞质均有 iNOS 表达， 但表 达极弱。4 个月、 6 个月时各染氟组 iNOS 的表达量 高于对照组 P ＜0． 05或 0． 01 ，且各染氟组间差异 有统计学意义 P ＜ 0． 05 ; 6 个月时各染氟组大鼠 睾丸组织 iNOS 蛋白的表达较 4 个月时增加 P ＜ 0． 01 。见图 1、 表 2。 图 1各组大鼠 4 和 6 个月时睾丸组织 iNOS 蛋白的表达 免疫组化 400 A 4 个月时的对照组;B 4 个月时的低氟组; C 4 个月时中氟组; D 4 个月时的高氟组; E 6 个月时的对照组; F 6 个月时的低氟组;G 6 个月时的中氟组;H 6 个月时的高氟组 Figure 1． Expression of iNOS in the testes of different groups of rats after exposed to fluoride for 4 and 6 months immunohistochemistry 400 ANormal control at 4 months;BLow fluorosis at 4 months;CModerate fluorosis at 4 months;DHigh fluorosis at 4 months;ENormal control at 6 months;FLow fluorosis at 6 months;GModerate fluorosis at 6 months;HHigh fluorosis at 6 months． 778中华男科学杂志2014 年 10 月第 20 卷 第 10 期Natl J Androl，Vol． 20，No． 10，October 2014 表 2各组大鼠血清 iNOS 活性、 睾丸组织 iNOS 蛋白表达 OD 值和睾丸生精细胞 AI 的比较 n 5，x s Table 2． Serum iNOS activity，optical density ODof the iNOS expression，and apoptotic index AIof spermatogenic cells in the testes of different groups of rats after exposed to fluoride for 4 and 6 months n 5，x s Group iNOS U/ml 4 mo6 mo OD 4 mo6 mo AI 4 mo6 mo Control8．25 0．338．35 0．350．0013 0．00020．0016 0．00010．46 0．110．54 0．11 Low fluorosis9．42 0．72*10．26 0．46＊＊0．0733 0．0085*0．1084 0．0126＊＊▲8．83 1．64*10．4 2．70＊＊▲ Moderate fluorosis11．19 0．56＊＊△11．55 0．42＊＊△0．1425 0．0272＊＊△0．2077 0．0204＊＊△▲17．24 3．96＊＊△22．2 3．96＊＊△▲ High fluorosis11．44 0．59＊＊△11．94 0．28＊＊△0．5275 0．0791＊＊△﹟0．7173 0．0656＊＊△﹟▲44．21 7．85＊＊△﹟49．6 4．77＊＊△﹟▲ 与对照组比较， * P ＜0． 05， ＊＊P ＜0． 01; 与低氟组比较， △P ＜0． 05; 与中氟组比较， ﹟P ＜0． 05; 与染毒4 个月时比较， ▲P ＜0． 01 * P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01 versus the control group;△P ＜0． 05 versus the low fluorosis group;P ＜0． 05 versus the moderate fluorosis group;▲P ＜0． 01 versus 4 months． 2． 7睾丸生精细胞凋亡检测结果染氟组睾丸组 织中出现大量细胞核被染成棕黄色的凋亡细胞， 主 要为靠近基底膜的精原细胞和精母细胞， 睾丸支持 细胞和间质细胞少见凋亡发生。对照组生精细胞偶 见有凋亡发生。4 和 6 个月时各染氟组大鼠生精细 胞 AI 较对照组升高 P ＜0． 01 ， 且各染氟组间差异 有统计学意义 P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01 ; 6 个月时各 染氟组大鼠睾丸生精细胞 AI 较 4 个月时升高 P ＜ 0． 01 。见表 2、 图 2。 图 2各组大鼠睾丸组织睾丸生精细胞凋亡观察 TUNEL 400 A 4 个月时的对照组;B 4 个月时的低氟组; C 4 个月时中氟组; D 4 个月时的高氟组; E 6 个月时的对照组; F 6 个月时的低氟组;G 6 个月时的中氟组;H 6 个月时的高氟组 Figure 2． Apoptotic index of spermatogenic cells in the testes of different groups of rats after exposed to fluoride for 4 and 6 months TUNEL 400 ANormal control at 4 months;BLow fluorosis at 4 months;CModerate fluorosis at 4 months;DHigh fluorosis at 4 months;ENormal control at 6 months;FLow fluorosis at 6 months;GModerate fluorosis at 6 months;HHigh fluorosis at 6 months． 878中华男科学杂志2014 年 10 月第 20 卷 第 10 期Natl J Androl，Vol． 20，No． 10，October 2014 2． 8iNOS 蛋白表达与生精细胞 AI 相关性分析 大鼠睾丸组织 iNOS 蛋白表达与睾丸生精细胞 AI 呈 正相关 r 0． 962， P ＜0． 01 。 2． 9血清 T 水平与生精细胞 AI 的相关性分析血 清 T 水 平 与 睾 丸 生 精 细 胞 AI 呈 负 相 关 r －0． 744， P ＜0． 01 。 3讨论 凋亡是细胞接受到某种信号或受到某种刺激后 发生的一种主动的死亡过程， 它受多种相关基因的 调控。机体内过量氟可作用于睾丸并引起生精细胞 凋亡率升高， 并被认为是氟致雄性大鼠生殖功能损 伤的重要机制之一 ［3， 12 ］。本实验结果显示， 各染氟 组睾丸生精细胞的 AI 明显高于对照组， 且随染氟剂 量的增加和染氟时间的延长而加重， 与 Zhang 等 ［3 ］ 和 Krasowska 等 ［12 ］报道的结果相似。 生理情况下， 机体内氧化系统/抗氧化系统处于 动态平衡， 抗氧化酶可将机体内过量的氧化产物及 时清除; 当受到外源性因素刺激时， 活性氧的产生超 过清除能力， 氧化系统/抗氧化系统失衡， 引起机体 组织脂质过氧化水平升高， 导致生物大分子结构和 功能改变， 对靶器官造成损伤 ［13 ］， 在睾丸中则导致 睾丸组织细胞的结构和功能受损， 从而影响男性的 生殖功能 ［14 ］。研究证实， 过量氟使机体内产生大量 超氧阴离子和羟基等活性氧和活性氮自由基， 导致 机体氧化应激损伤［3， 15 ］。SOD 是重要的酶类抗氧化 剂， 被称为体内抗氧化系统的第一道防， 是清除活性 氧的重要物质之一， 可保护机体免受氧化损伤， 对机 体的氧化和抗氧化平衡起着非常重要的作用， SOD 的活性可以反映机体的抗氧化能力。MDA 是脂质 过氧化产生的产物， 其含量可间接反映机体活性氧 的水平和脂质过氧化程度。iNOS 是氧化应激过程 中一种重要的酶， 生理条件下表达极少， 但当机体受 到诱生因素的刺激时， 氧化应激状态下 iNOS 表达 增加， iNOS 活性升高， iNOS 催化 L- 精氨酸能力极 强， 迅速产生大量的 NO， NO 是具有生物活性的自 由基之一， 对组织器官造成氧化损伤。本实验结果 显示， 各染氟组雄性大鼠血清 SOD 活力均较对照组 显著降低， MDA 含量和 iNOS 活性较对照组明显增 加， 提示燃煤型氟中毒可导致雄性大鼠机体产生明 显的氧化应激损伤， 与相关报道一致 ［3， 14 ］。 血清 T 水平与生精细胞凋亡有密切关系［16 ］。T 是主要由睾丸间质细胞分泌的类固醇激素， 氟可能 通过对间质细胞的损伤而影响 T 的合成和分泌 ［7 ］。 血清 T 水平降低可能通过激活 Fas/FasL 系统， 从而 诱发生精细胞凋亡 ［16 ］。本实验结果中， 各染氟组大 鼠血清 T 水平改变， 且与生精细胞凋亡指数呈负相 关。我们分析认为， 燃煤氟中毒可能通过抑制雄性 大鼠血清 T 的合成和分泌， T 水平降低， 激活 Fas/ FasL 系统， 从而诱发生精细胞凋亡。 生精细胞凋亡与 iNOS 蛋白表达增加亦有密切 关系。机体内发生氧化应激可引起睾丸组织细胞损 伤， 诱发生精细胞凋亡 ［3， 14 ］。iNOS 蛋白表达增加则 iNOS 对 L- 精氨酸催化活性增强， 迅速产生大量 NO， 引起睾丸组织内 NO 增多， 过多的 NO 影响睾丸的 生精功能， 改变了精子生存微环境， 可能会抑制性激 素的分泌和精子的发育。大量研究证实， NO 能调 节睾丸的血供、 T 的分泌、 精子的发生及获能， 导致 精液质量下降， 最终影响雄性生殖功能 ［17- 18 ］。此 外， NO 还可以与 O2 － 迅速反应生成毒性更强的 ONOO － ， 损伤生精细胞诱发凋亡 ［17 ］。本实验发现， 各染氟组大鼠睾丸组织 iNOS 蛋白表达与生精细胞 凋亡指数呈正相关， 表明燃煤型氟中毒可使大鼠睾 丸 iNOS 蛋白表达增加， iNOS 活性增加， 睾丸脂质过 氧化水平升高。 根据本实验结果， 并结合前期实验研究， 我们推 测燃煤型氟中毒可能通过以下两种途径诱发睾丸生 精细胞凋亡 ①大量外源性氟对雄性大鼠机体产生 刺激作用， 使机体对睾丸 iNOS 蛋白表达的调控作 用上调， 睾丸 iNOS 蛋白增多， 睾丸内外 iNOS 活性 升高， 产生大量 NO， 氧化系统/抗氧化系统失衡， 睾 丸内外脂质过氧化水平升高， 引起睾丸生精细胞的 生物大分子结构和功能改变， 损伤生精细胞、 诱发凋 亡; ②过量氟抑制雄性大鼠 T 的合成和分泌， 引起 T 水平降低， 激活 Fas/FasL 系统， 从而诱发生精细胞 凋亡， 最终影响睾丸的生殖功能。 综上所述， 燃煤型氟中毒雄性大鼠生精细胞凋 亡与氧化应激损伤和血清 T 紊乱有密切关系; iNOS 蛋白表达调控以及 T 的合成、 分泌可能参与燃煤型 氟中毒对雄性大鼠生殖功能损害。 参考文献 ［ 1］O＇Kelly F，Manecksha ＲP，Cullen IM，et al． Electr ejaculatory stimulation and its implications for male infertility in spinal cord injuryA sho