应用卤素同位素标记-质谱技术测定复杂基质中氨基酸及胺类物质的研究.pdf

分类号 举导． JJ 0 6 2 8 ．5 1 8 2 1 3 0 6 9 0 1 5 压，娄料技大学 A NU N I V E R S I T Y O FS C l EN C ET E C H N O L o GY 密级 硕士学位论文 T h e s i sf o rM a s t e r ，sD e g r e e 应用卤素同位素标记一质谱技术测定复杂基质中 氨基酸及胺类物质的研究 申请人姓名 指导教师 学科门类 学科名称 研究方向 杨倩倩 陈福欣 工学 应用化学 有机化学 2 0 21 年6 月 万方数据 西要料技太学 学位论文独创性说明 本人郑重声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及其取得 研究成果。尽我所知，除了文中加以标注和致谢的地方外，论文不包含其他人或集体己 经公开发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西安科技大学或其他教育机构的学位 或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中做 了明确的说明并表示了致谢。 学位论文作者签名 褐嵋嘱 日期2 0 2 1 年6 月16 日 学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即研究生在校攻读学位期间论文工 作的知识产权单位属于西安科技大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文 的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位 为西安科技大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名 捣儒嚆 指导教师签名 缈夕 2 0 2 1 年6 月16 日 万方数据 论文题目应用卤素同位素标记．质谱技术测定复杂基质中氨基酸及胺 类物质的研究 学科名称应用化学 硕士生杨倩倩 指导教师陈福欣 摘要 签名 签名 褐嵋儒 缈夕 有关氨基酸、胺类物质的分析多使用衍生化技术，以改变分析物的性质。但现阶段 己报道的衍生化试剂，由于数据精确度不高、价格昂贵、衍生产物质谱信号易受复杂基 质干扰、数据处理困难等原因，应用范围受到了限制。本文针对这一问题，筛选了4 种 新型的衍生化试剂，对其衍生产物的卤素同位素峰和抗基质干扰能力进行了研究，并使 用P 汕o n 改善了数据处理过程。 首先，对含有卤素同位素C l 的衍生化试剂 4 ．氯苯磺酰氯 与甘氨酸的衍生反应为 模型进行了反应条件探究。通过对反应物投料比、反应物投料的顺序、衍生反应时间、 衍生反应温度、碱性环境、终止剂的添加进行对比，确定了最佳的衍生条件。由此得到 的衍生产物稳定，无需经过纯化处理。最重要的是，在衍生产物的色谱图及质谱图中可 以明显的看到卤素C l 的同位素峰，这便于对复杂基质中没有荧光吸收或紫外吸收的特 定目标化合物进行快速的定性分析。 其次，由于实际样本的数据基质复杂、处理过程耗时等，使数据处理部分不易完成。 在此基础上提出了基于P 汕o n 脚本对U P L C ．Q ．T O F 数据进行分析的方法，在4 种新型 卤素同位素衍生化试剂 4 ．氯苯磺酰氯、3 ，5 ．二氯苯磺酰氯、4 ．溴苯磺酰氯、4 ．溴．2 ．氯苯 磺酰氯 衍生产物的质谱图中找出了含有一个C l 元素、两个C l 元素、一个B r 元素、 一个C l 元素和一个B r 元素衍生产物的同位素峰。此方法大大提高了获取数据的效率， 节约了时间成本，实验结果证明了筛选数据的有效性和优越性，为分析实际样本的质谱 数据打下了坚实的基础。 最后，由于健康人体尿液、牛奶样本的实际样本中的复杂基质干扰了氨基酸及胺类 物质的检测分析，因此，本文建立了一种卤素同位素标记．质谱技术测定复杂基质中氨 基酸及胺类物质的研究。发现健康人体尿液使用水、甲醇和乙腈萃取时，乙腈效果最好， 衍生化处理之后在尿液样本中发现了尿素、酪氨酸、尿酸；市售牛奶首先使用甲醇 溶 剂与牛奶的比例为3 1 沉淀蛋白质，再经D C M 去除脂质，经衍生化和数据处理之后 并未出现同位素峰，可据此推断该种牛奶样品没有添加非蛋白氮，但在人为添加三聚氰 胺的牛奶样品中检测到了衍生物的同位素峰。 万方数据 关键词卤素同位素；衍生化技术；u P L c ．T o F ．M s ；P 灿o n 研究类型应用研究 万方数据 S u b j e c t S p e c i a l 锣 N a m e S t u d yo nt h ed e t e r m i n a t i o no fa m i n 0a c i d sa n da m i n e si n c o m p l e x m a t r i x b yh a l o g e ni s o t o p el a b e l i n g m a s s s p e c t r o m e t r y A p p U e dC h e m i s t r y Q i a n q i a nY a n g I n s t r u c t o rF u x i nC h e n A B S T R A C T S i g n a t u r e S i g n a t u r e 嘶n 7 加协 3 T h ea n a l y s i so f 锄i n oa c i d sa n d 锄i n e sm o s t l yu s e sd e r i v a t i z a t i o nt e c l l l l i q u e st oc h a n g e t h ep r o p e n i e so ft h ea n a l 舛e s ．H o w e v e r ，t h ed e m a t i z a t i o nr e a g e n t st h a th a v eb e e nr e p o m d a t t h i ss t a g ea r el i m i t e di nt h e i ra p p l i c a t i o ns c o p ed u et ol o wd a t aa C c l l I ’a C y ，h i g hp r i c e ， s u s c e p t i b i l i t yt oc o m p l e xm a t r i xi n t e r f e r e n c eo fd e r i v a t i V ep r o d u c tm a s ss p e c 仃o m e 衄s i g n a l s ， a n dd i m c u l t yi nd a t ap r o c e s s i n g ．I I lr e s p o n s et ot h i sp r o b l e m ，t h i sp a p e rs c r e e n e d4n e w d e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t s ， s m d i e dt h eh a l o g e ni s o t o p ep e a k sa n da n t i - m 疵xi n t e r f e r e n c e c a D a b j 】i t ie so ft h e i rd e r i v a t i v e s ．a n du s e dP V t h o nt oi n l p r o v et h ed a t ap I ．o c e s s l n gp I ．o c e s s ． c a D a b l l i t l e so 士t h e l rd e n V a t l V e s ，a n du s e dr y t n o nt ol n l p r o V em e Q a I ap I ．o c e s s l n gp r o c e s s F i r s t l y ，t h ed e r i v a t i z a t i o nr e a c t i o no ft h ed e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t 4 - c h l o r o b e n z e n e s u l f o n y l c h l o r i d e c o n t a i n i n gt h eh a l o g e ni s o t o p eC l 4 一c h l o r o b e I 亿e n e s u l f o n y lc h l o r i d e w i t hg l y C i n e w a su s e da sam o d e lt oe X p l o r et h er e a c t i o nc o n d i t i o n s ．T h eo p t i m a ld e m a t i z a t i o nc o n d i t i o n s w e r ed e t e m l i n e db yc o m I a r i n gt h er e a c t a n tf e e dr a t i o ，t h eo r d e ro fr e a c t a n tf e e d ，t h e d e r i v a t i z a t i o nr e a c t i o nt i m e ，t h ed e r i v a t i z a t i o nt e I n p e r a m r e ，t h ea l k a l i n ee I Ⅳi r o I u n e n t ，a n dt h e a d m i o no ft e r m i n a t o r ．T h e L e m e dp r o d u c tt h u so b t a i n e di ss t a b l ea n dd o e sn o tn e e dt ob e p u r i f i e d ．T h em o s ti r n p o r t a n tt h i n gi st h a tt h ei s o t o p ep e a k so fh a l o g e nC lc a nb ec l e a r l ys e e n i nt h ec h r o m a t o 鲫ma n dm a s ss p e c m u no ft h ed e r i v a t i v ep r o d u c t ，w h i c hf - a C i l i t a t e sr a p i d q u a l i t a t i v ea n a l y s i so fs p e c i f i ct a 曜e tc o I n p o u n d sw i t h o u t n u o r e s c e n c eo ru l 仃{ w i o l e t a b s o 印t i o ni nc o n l p l e xm 撕c e s ． S e c o n d l y ，t h ed a t ap r o c e s s i n gp a n i sn o te a s yt oc o n l p l e t ed u et ot h ec o I n p l e Xd a t am 砷淑 o ft h ea c t u a ls a n 叩l ea n dt h et i m e ．c o n s u n l i n gp r o c e s s i n gp r o c e s s ．O nt h i sb a s i s ，am e t h o df o r a n a l y z i n gU P L C ．Q ．T O Fd a t ab a s e do nP y t h o ns c r i p t sw a sp I ．o p o s e d ．F o u rn e wh a l o g e n i s o t o p e d e m a t i z a t i o n r e a g e n t s 4 - c h l o r o b e n z e n e s u l f I o n 姐 c h l o r i d e ， 3 ，5 ．d i c h l o r o b e n z e n e s u l f o l l y lc h l o r i d e ， 4 一B r o m o b e n z e n e s u l f o n y lc h l o r i d e ， 4 - b r o m o ．2 ．c h l o r o b e n z e n e s u l f o I l y lc h l o r i d e d e r i v a t i v ep r o d u c t so ft h em a s ss p e c 饥胍f o u n d 万方数据 t h ei s o t o p e sc o n t a i n i n go n eC le l e m e n t ，t w oC le l e m e n t s ，o n eB re l e m e n t ，o n eC le l e m e n ta n d o n eB re l e m e n td e r i V a t i V ep r o d u c t sp e a k ．T h i sm e t h o dg r e a t l yi n l p r o V e st h ee m c i e n c yo fd a t a a c q u i s i t i o na n ds a V e st i m ea n dc o s t ．T h ee x p e r i m e n t a lr e s u n sp r o V et h ee f f e c t i v e n e s sa n d ●■．●●●●●⋯●●●●● S U p e n O n WO IS C r e e n l n gd a t a ，a n dl a VaS O l l dt O W l d a t l O nt O rt n ea n a l V S l SO tm a S SS D e C t r o m e ”y d a t ao fa c t u a ls a m p l e s ． F i n a l l y ，b e c a u s et h ec o I n p l e xm 枷xi nt h ea c m a ls a n 叩l e so fh e a l t h yh I m a nu r i n ea n d m i l ks a n 叩l e si n t e r f ．e r e sw i t ht h ed e t e c t i o na n d a n a l y s i so f 锄i n oa c i d sa n d 锄i n e s ，t h i sp a p e r e s t a b l i s h e sah a l o g e ni s o t o p el a b e l i n g - m a s ss p e c t r o m e t r yt e c l u l i q u ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no f 锄i n oa c i d sa n d 锄i n e si nc o I n p l e xm 疵c e sR e s e a r c h ．I tw a sf o u n dt h a tw h e nh e a l t h yh u m a n u r i n ew a se x t r a c t e dw i t hw a t e r ，m e t h a n o la n da c e t o n i t r i l e ，a c e t o n i 仃i l eh a dt h eb e s te f f e c t ． A R e rd e r i V a t i z a t i o n ，u r e a ，呻s i n e ，a n d 嘶ca c i dw e r ef o u n di n 嘶n esa ] m p l e s ．C o I m e r c i a l m i l kf i r s tu s e sm e t h a n o l t h er a t i oo fs o l V e n tt om i l ki s3 1 t op r e c i p i t a t ep r o t e i n s ，a n dt h e n r e m o V e sl i p i d sb yD C M ．A R e rd e r i V a t i z a t i o na n dd a t ap r o c e s s i n g ，t h e r ei sn oi s o t o p ep e a kI t c a nb ei n f e r r e dt h a tt h i sk i n do fm i l ks a n 叩l ei sn o ta d d e dN o n p r o t e i nn i t r o g e n ，b u tt h e i s o t o p ep e a ko ft h ed e r i V a t i V ew a sd e t e c t e di nt h em i l ks 锄n p l ea m f i c i a l l ya d d e dw i t h m e l a m i n e ． K e yw o r d s H a l o g e ni s o t o p e ；D e r i V a t i z a t i o nt e c l u l i q u e ；U P L C ．1 ’O F ．M S ；P y t h o n T h e s i s A p p l i e dr e s e a r c h 万方数据 目录 目录 1 绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 1 ．1 生物样本中氨基酸分析简述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 1 ．1 ．1 氨基酸代谢疾病⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 1 ．1 ．2 氨基酸的生理作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 1 ．1 ．3 氨基酸的检测及其临床意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 1 ．1 ．4 生物样本中氨基酸含量测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 1 ．1 ．5 氨基酸质谱分析衍生化方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 1 ．2 生物胺类成分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一6 1 ．2 ．1 生物胺的生理作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 1 ．2 ．2 生物胺的毒性作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 1 ．2 ．3 生物胺的衍生化试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 1 ．3 研究方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．9 1 ．3 ．1 飞行时间质谱技术 T i m eo f F l i g h tM a s sS p e c t r o m e t e r ，T O FM S ⋯⋯⋯．9 1 ．3 ．2 同位素标记质谱技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 0 1 ．4 质谱数据处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 4 1 ．5 研究内容及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15 2 衍生化试剂的条件筛选和反应研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 6 2 ．1 实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 6 2 ．1 ．1 药品与试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 6 2 ．1 ．2 仪器与设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 6 2 ．2 实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 7 2 ．2 ．1 甘基酸的衍生化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 7 2 ．2 ．2 核磁共振波谱仪检测 N M R ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．18 2 ．2 ．3G C ．M S 检测条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．18 2 ．2 ．4U P L C ．Q ．T O F 检测分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 9 2 ．2 ．5 氨基酸的衍生化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一2 0 2 ．3 结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 0 2 ．3 ．1 衍生化条件优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一2 0 2 ．3 ．2 甘氨酸衍生产物的核磁谱图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 3 2 ．3 ．3 甘氨酸衍生产物的G C ．M S 分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 4 2 ．3 ．4 甘氨酸衍生产物的U H P L C ．Q ．T O F 分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一2 6 2 ．3 ．5 混合氨基酸的衍生化反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 8 2 ．4 本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 9 3 基于P 灿o n 编程对衍生产物的质谱分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 0 3 ．1 实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 0 3 ．1 ．1 药品与试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 0 3 ．1 ．2 仪器与设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31 3 ．2 实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31 3 ．2 ．1 甘氨酸与不同试剂的衍生化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 1 3 ．2 ．2U P L C ．Q ．T O F 数据处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31 万方数据 目录 3 ．3 结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 8 3 ．3 ．1 同位素原子的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3 8 3 ．3 ．2 氨基酸衍生产物分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一4 0 3 ．4 本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 1 4 实际样本中氨基酸和胺类物质的检测分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一4 2 4 ．1 实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 2 4 ．1 ．1 药品与试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 2 4 ．1 ．2 仪器与设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 2 4 ．2 实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 3 4 ．2 ．1 尿液样品的收集和准备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一4 3 4 ．2 ．2 牛奶样品的收集和准备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 3 4 ．3 结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 4 4 ．3 ．1 尿液样品的衍生化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4 4 4 ．3 ．2 牛奶样品的衍生化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一4 6 4 ．4 本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 9 5 结论与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一5 0 5 ．1 结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5 0 5 ．2 创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 0 5 ．3 展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51 致{ 谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 2 参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 3 附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 9 万方数据 主要符号一览表 万方数据 1 绪论 1 ．1 生物样本中氨基酸分析简述 1 ．1 ．1 氨基酸代谢疾病 1 绪论 氨基酸代谢病也被称为氨基酸病 锄i n o a c i d o p a t h y ，或氨基酸尿症 锄i n o a c i d u r i a 。 一般可分为两大类一类是酶缺陷，阻碍了氨基酸分解代谢；另一类是氨基酸吸收转运 系统的缺陷。在R o s e n b e r g 和S c r i v e r 鉴定的4 8 种遗传性氨基酸病中，至少有一半患者 出现神经系统异常。当神经系统异常时，通常只有轻微的智力迟钝，直到发病2 ～3 年 才有明显的症状。与其他遗传性代谢性病一样，氨基酸类疾病不影响胎儿的生长发育或 分娩，早期也无明显迹象。 氨基酸代谢疾病可发生在代谢途径的上游和下游，某些代谢物浓度的升高也可能激 活其他路径。倘若氨基酸变异，而又恰好位于功能位点上，疾病的临床表现也会随之发 生明显的变化。例如，在酶的催化位点上，或是在和其他分子发生作用的位点上发生变 异。如苯丙氨酸、蛋氨酸和亮氨酸，它们是新生儿遗传代谢紊乱的重要生化指标。当一 种与特定氨基酸代谢途径相关的酶在新生儿体内缺失时，就会发生氨基酸的异常积累， 从而阻断必需化合物合成的途径，干扰正常的身体功能。因此，在没有得到及时治疗的 婴儿患者中，智力障碍、出血障碍或器官功能受损无法恢复的情况比比皆是。此处介绍 几种典型的氨基酸代谢疾病。 1 苯丙酮尿症 P K U 苯丙氨酸羟化酶活性降低，导致血液中苯丙氨酸浓度异 常升高。如果不及时治疗，患者将会有严重的智力障碍。新生儿筛查的过程中，可以检 测苯丙氨酸或其代谢物的浓度是否过量。除此之外还发现，如果对患有P K U 的婴儿， 限制摄入含有苯丙氨酸的饮食，他们的智力发育障碍会明显减轻。但是，苯丙氨酸的摄 入不能完全停止，因为它是一种必需氨基酸。 2 枫糖尿病 M S U D 枫糖尿病多见于新生儿，枫糖尿病和糖尿病一样是属于 代谢性疾病，比较罕见，而且属于遗传病。患儿表现为精神迟滞、智力缺陷、痉挛状态 或阵痛发作，婴儿期喂养困难。患儿需要终生检测体内支链氨基酸的浓度，补充维生素 B 1 ，且无法治愈，需要终身治疗。只能通过积极的治疗改善症状，延长生命。一般患有 枫糖尿病的患者会在体液中出现特殊的枫糖臭味，严重的会损伤神经系统。 3 酪氨酸血症 t 邺s i n e m i a 是一种特别罕见的常染色体隐形遗传代谢病。生 物酶的基因突变抑制了酪氨酸的降解，使它在血液中的浓度异常升高，最终患上酪氨酸 血症。K a u 劬a n [ 1 】提到，在高苯丙氨酸血症患者的血液中苯丙氨酸浓度超过1 ．2I 洲，该 万方数据 西安科技大学硕士学位论文 浓度是正常水平 O ．0 5 5 ～O ．0 6 0I 州 的2 0 倍。F 啪c i s 【2 】等也曾报道了1 例1 1 岁患者， 该患者血浆酪氨酸浓度为1 ．4I 洲。 4 H a 咖u p 病这种疾病在姓H a 咖l l p 的一个家族中发现。之后研究表明，该病 是由于肠粘膜和肾小管上皮细胞转运中性氨基酸障碍引起的。但迄今为止，许多人仍然 无症状，这可能是因为患者摄入了过量的蛋白质、色氨酸、维生素B 3 等。然而，即使 在无症状的患者中，对H a 咖l 】p 障碍的准确诊断也是必要的[ 】，以此确保H a r 仃1 l l p 障碍 与其他氨基酸尿症的正确区分。H a i j e sH 等人【5 】研究表明，这种潜在的误诊可以通过定 量、可视化和计算尿氨基酸来克服。 这几种氨基酸代谢疾病被归类为新生儿的主要代谢疾病，它们的显著特点是某些氨 基酸在血液中的浓度异常引起的。美国、韩国在内的许多发达国家在关于找到新的治疗 技术方面，给予了一定的财政支持，并强制性实施。针对这一情况，K i mMI 【6 ] 等人设 计了三种新的大肠杆菌，可以与样品中的苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸产生不同的荧光 信号，通过测定荧光信号检测这些氨基酸，以便更加准确的诊断疾病。 氨基酸代谢疾病通常是通过测定干燥血点标本中目标氨基酸的浓度来进行临床诊 断。目前，有7 0 多种不同的代谢性疾病被纳入新生儿筛查，其中约9 0 ％采用E S I ．M S ／M S 的筛查方法，提高了筛查的灵敏性和特异性，降低了假阳性率。以串联质谱技术为例， 建立截断值，可以使假阴性率降至零水平。假阳性病例的数量有时会很高，特别是同型 半胱氨酸尿症、甲基丙二酸血症和丙酸血症 甲硫氨酸和丙酰肉碱是这三种疾病的诊断 标志 。由于疑似阳性病例需要进行确认检测，因此受疾病影响的新生儿的家庭承受了 不必要的压力，并增加了代谢诊断实验室的分析负担。在此背景下，D 6 n e sm l i a [ ．7 】研究 证明，纳米喷雾电离与高分辨率质谱 n S ．H R ．M S 的结合提供了与L C ／M S 方法相媲美 的代谢物覆盖范围。该方法可广泛检测需要筛查的代谢性疾病，例如P K U 和中链酰基 辅酶A 脱氢酶缺乏症 M C A D D 。 1 ．1 ．2 氨基酸的生理作用 氨基酸链构成的有机大分子，由肽键连接形成蛋白质，是构成蛋白质的基本物质。 分子通式带有一个显碱性的氨基，和显酸性的羧基。它具有多种生理作用，属于生物活 性分子，与人、动物的身体健康密切相关。作为构成生命的基石，长期以来在人类和动 物的营养和健康维护中发挥着重要作用。由于它的功能性和手性所产生的特性，这类化 合物在化学工业中也具有极其重要的生物化学意义。在2 0 种标准蛋白质氨基酸中，9 种必需氨基酸 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、苯 丙氨酸和色氨酸 占据重要位置。但它们不能在动物和人类体内合成，所以必须与饲料 或食物一起摄入。氨基酸不仅为人体和动物所必须，同时也应用于工业生产[ 1 9 1 。比如用 于增味剂的谷氨酸，在动物饲料中添加的赖氨酸、苏氨酸、色氨酸等。同时，在代谢组 2 万方数据 1 绪论 学、各类医学、生物制药等方面也都扮演着特别重要的角色。 氨基酸在生命活动中有着不可或缺的作用，整理见表1 ．1 。 表1 ．1 氨基酸的生理作用 T I a b ．1 ．1P h y s i o I o g i c a lr o l e o fa m i n oa c i d s 1 ．1 ．3 氨基酸的检测及其临床意义 氨基酸和生物胺是天然化合物，存在于各种食物中，如饮料[ 9 ，1 1 1 、鱼[ 1 2 ，13 1 、奶酪[ 1 4 ，1 5 】 和肉制品【1 0 ，1 6 1 ，它们有很重要的生理作用和生物活性【1 7 ，18 1 。有研究表明，饮食中摄入低 万方数据 西安科技大学硕士学位论文 水平的A A s 或B A s 对健康有诸多益处。但当摄入过量时，也可能会导致生理功能的问 题。氨基酸在许多代谢途径中作为基础代谢物和调节因子发挥着至关重要的作用。 从生物学的观点来看，氨基酸可以说是最重要的化合物。它们不仅是蛋白质的基本 结构单位，而且是能量的来源，是神经递质、卟啉、多胺和一氧化氮生物合成的前体。 此外，一些氨基酸作为神经递质发挥着重要作用。因此，这些化合物的测定在评价食品 的营养质量和某些药物的质量控制中，以及在临床诊断中都极为重要。由于代谢的变化， 患者体内的氨基酸浓度与健康人群不同。B o d i a n 【2 0 ] 等人报道指出，成骨不全症 O I 或 脆性骨病，通常是由于甘氨酸残基的错义突变造成的，该甘氨酸残基存在于重复的I 型 胶原三螺旋区域的序列中。G 1 y - X ．Y 三联体中的X 和Y 可以是任何氨基酸，通常是脯 氨酸和羟脯氨酸。由于较大的氨基酸无法在不破坏结构的情况下被紧密压缩在三重螺旋 的核心中，所以甘氨酸的位置对蛋白质的完整性至关重要。2 0 2 0 年，孙勇[ 2 1 】将肝硬化 合并肝性脑病患者分为两组，一组注射门冬氨酸鸟氨酸注射液，另一组注射鼻饲支链氨 基酸，结果表明，两种药物均可以有效治疗肝硬化合并肝性脑病患者，但后一组药物治 疗效果更好，能很好的改善患者血液指标。 生物体内氨基酸的含量可以反映出肌体的健康状况，如若找到一种快速便捷的方法 对血浆中的氨基酸进行测定，会对相关的疾病治疗、病情检测提供依据[ 2 2 1 。在不同的代 谢物中，氨基酸位于代谢中心，因此作为各种病理状况的标记物出现，并在许多关键过 程中被合成和降解[ 2 3 1 。据报道，氨基酸在糖尿病风险评估【2 4 】和肝纤维化诊断【2 5 】中是非 常有价值的。与此同时，有研究证明，氨基酸谱有筛查肺癌[ 2 6 1 、胃癌【2 7 1 、乳腺癌[ 2 8 1 、 结直肠癌[ 2 8 ] 和前列腺癌【2 7 ] 的潜力。 1 ．1 ．4 生物样本中氨基酸含量测定方法 氨基酸是代谢谱的重要靶点。几十年来，氨基酸分析一直是通过阳离子交换或反相 液相色谱结合柱前或柱后衍生化来完成的。质谱技术不仅在灵敏度上可以与光学检测相 媲美，而且具有较高的选择性，在分析生理体液中游离氨基酸方面取得了很大的进展， 低温探针的出现也使核磁共振波谱学达到了分析游离氨基酸所需的检测限度。但仍有进 一步改进的空间，如扩大分析光谱，减少样品制备和分析时间，自动化，合成负担得起 的同位素标准衍生化试剂等。 分析氨基酸的高效液相色谱 H P L C 方法已经发展了5 0 多年。自1 9 5 8 年开始， 就开发了氨基酸自动分析仪系统，用于氨基酸的比色检测。原理是氨基酸与茚三酮试剂 反应后呈紫色，用阳离子交换树脂逐步提高柠檬酸缓冲溶液的p H ，分步分离氨基酸。 随着高效液相色谱性能的不断提高和高效色谱柱树脂的开发，该分析仪不仅可以分析蛋 白质水解物，还可以分析生物液体中的氨基酸。但灵敏度不高，检测限仅为几个皮摩尔。 自2 0 世纪7 0 年代末以来，除了茚三酮法外，已开发了多种技术，用于将氨基酸转化为 4 万方数据 1 绪论 敏感的可分析荧光衍生物。现应用较多的衍生化试剂包括O P A ．3 M P A 【2 9 1 、邻苯二甲醛 O P A [ 3 0 - 3 4 1 、氯甲酸芴甲酯 F M O C ．C 1 【3 5 。4 0 1 、5 ．二甲氨基萘磺酰氯 d a n s v l ．C 1 [ 4 0 4 2 1 、 4 ．氟．7 ．硝基．2 ，1 ，3 ．苯并恶二唑 N B D ．F [ 4 4 1 、6 ．氨基喹啉基-