白腐真菌预处理对煤厌氧发酵产甲烷的影响_张怀文.pdf

第 48 卷 第 2 期 煤田地质与勘探 Vol. 48 No.2 2020 年 4 月 COAL GEOLOGY biological pretreatment; white rot fungi; anaerobic fermentation; methane; Qianqiu coal mine of Yima in Henan ChaoXing 第 2 期 张怀文等 白腐真菌预处理对煤厌氧发酵产甲烷的影响 121 煤层气是一种潜力巨大且尚未被完全开发的清 洁能源，在世界能源结构中占有重要地位[1]。煤层 气的勘探开发不仅能够减缓温室效应，降低矿井通 风成本，同时也能获得高效清洁的甲烷能源，而微 生物增产煤层气MECBM技术是增加煤层气资源 量的重要途径之一[2]。 一 般 来 讲 ， 煤 微 生 物 厌 氧 降 解 产 甲 烷 过 程MECBM 技术核心包括水解阶段发酵细菌、水 解细菌、产酸阶段产酸菌、同型产乙酸菌、产甲 烷阶段产甲烷菌等多阶段多菌群的协同完成[3-4]， 且水解阶段是整个过程的限速阶段[5]。前期预处理 是解决水解阶段限速问题的重要方法之一，主要包 括物理、化学及生物预处理等。研究表明，白腐真 菌生物预处理是一种优异的预处理方式，能够通过 木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶等关键酶 催化自由基链式反应，实现对木质素的矿化并将多 聚糖降解为可利用的单糖[6-8]。白腐真菌具有降解复 杂底物参与生化反应的物质，发酵反应的原料就是 底物，也相当于生化反应的反应物的能力，且降解 范围广、反应条件温和、适应性强，是对煤炭进行 生物降解和加工的一种新型研究方向[9-10]。白腐真 菌对煤的降解包括氧化和氢化两个过程，不仅可以 将部分煤样降解为气态小分子物质，而且有利于煤 质的精选和燃烧特性的优化[11]。徐一雯等[12]研究了 超声、微波及热碱预处理技术对厨余垃圾厌氧发酵 产甲烷的影响；夏大平等[13]研究了酸、碱预处理后 煤发酵联产氢气–甲烷生成特征与煤结构变化； 张亦 雯等[14]研究了 3 种不同 H2O2浓度预处理中、高阶煤 的生物甲烷生成潜力，发现 0.05H2O2直接注入煤层 或将预处理液注入煤层均可实现生物甲烷的增产。 目前声波、酸碱、氧化剂等物理、化学等多种 预处理方式对煤发酵产气的影响已多有报道[15-17]， 但鲜有报道生物预处理煤样的产气特征。鉴于此， 分别对白腐真菌预处理和未进行预处理的长焰煤进 行生物发酵产甲烷实验，研究分析产甲烷过程中不 同阶段产气量、化学需氧量COD、辅酶 F420活性 及煤表面结构变化等规律，为进一步证实白腐真菌 生物预处理的优越性和煤层生物气资源的商业化利 用提供支撑和借鉴。 1 实验材料与方法 1.1 实验材料 煤样选自河南义马千秋矿，煤的镜质体最大反 射率为 0.56，为长焰煤。煤层埋深 500 m，储层温 度 25C。在采煤工作面人工采集块状煤样＞8 cm 8 cm 8 cm后放在氦气填充密封的低温厌氧罐内， 并及时运往实验室密封保存。煤样的工业分析和元 素分析结果见表 1。 产气菌源来自焦作古汉山矿井水。在采煤工作 面涌水口处人工采集新鲜水样，通入氦气后运往实 验室冷藏保存。白腐真菌由河南理工大学煤层气生 物工程实验室提供。 表 1 义马千秋矿长焰煤的工业分析和元素分析 Table 1 Proximate and ultimate analysis of long flame coal 工业分析 ω/ 元素分析 ω/ MadAadVad FCadCdaf Hdaf Ndaf OSdaf 10.455.3231.1553.08 76.24 5.29 1.08 17.39 1.2 实验方案 以白腐真菌预处理煤样为实验组，未经预处理 煤样为对照组，其他条件均保持一致。实验前将煤 样破碎筛分至 100150 目0.11.5 mm，并储存在 干燥样品袋内。产气实验在 3 000 mL 发酵瓶中进 行，产生的气体通过排饱和食盐水法集于集气瓶 中图 1。主要实验流程如下。 a. 配置微量元素液 1.5 g 氨基三乙酸，0.5 g MnSO42H2O， 3.0 g MgSO47H2O， 0.1 g FeSO47H2O， 1.0 g NaCl，0.1 g CoCl26H2O，0.1 g CaCl22H2O， 0.01 g CuSO45H2O，0.1 g ZnSO47H2O，0.01 g H3BO3，0.01 g KAlSO42，0.02 g NiCl26H2O，0.01 g Na2MoO4与 1 000 mL 超纯水。 b. 配置产甲烷富集培养基 1.0 g NH4Cl， 0.1 g MgCl26H2O，0.4 g K2HPO43H2O，0.2 g KH2PO4， 1.0 g 酵母膏，0.001 g 刃天青，0.5 g L–半胱氨酸盐， 0.2 g Na2S， 2.0 g NaHCO3， 2.0 g 乙酸钠， 2.0 g 甲酸钠， 0.1 g 胰蛋白胨， 10 mL 微量元素液与 1 000 mL 矿井水。 c. 配置白腐真菌富集培养基 200 g 马铃薯， 20 g 葡萄糖，5 g 蛋白胨与 1 000 mL 超纯水，并将 白腐真菌菌种接种到 PDA 固体培养基上。 将配置好的白腐真菌和产甲烷培养基在35 0.5C 恒温培养箱内富集培养 45 d。 富集培养完成 后向富含白腐真菌的发酵瓶内加入 100 g 新鲜煤样， 好氧预处理 67 d。预处理结束后，保留煤颗粒沉淀 物并用 KOH 溶液中和预处理发酵液，同时向预处 理发酵瓶内加入同质量、同粒度的煤样及 1 000 mL 产甲烷富集液，轻轻摇晃至混合均匀，在预处理装 置基础上形成产甲烷装置。 实验装置如图 1 所示。 在液体取样口 4 每隔 3 d 抽取一次菌液，置于 ChaoXing 122 煤田地质与勘探 第 48 卷 1发酵瓶；2橡胶塞；3、6穿刺钢针；4液体取样口； 5气体取样口；7橡胶软管；8洗气瓶；9集气装置 图 1 生物产气模拟装置 Fig.1 Simulation device for biogenic gas production 50 mL 离心管内，并向离心管内充入氦气以保证其 厌氧条件，用封口膜密封后放置在 4C 冰箱内冷藏 保存。 1.3 分析方法 1.3.1 产气量 利用排水集气法测量产气量大小，即用量筒对 排水集气装置中的排水体积进行测量，水体积即为 产气量大小。 1.3.2 化学需氧量COD 采用 6B-200 型 COD 速测仪测试产甲烷过程中 发酵液的 COD 质量浓度。测试前对发酵液进行稀 释发酵液∶蒸馏水120∶。 取 7 支带有标号的洁 净 消 解 管 ， 分 别 对 应 不 同 取 液 阶 段 的 测 试 样 品0.15 mL，并依次向消解管内加入 1 mL C1试 剂一种氧化剂，5 mL C2试剂浓硫酸。将消解管 依次放入 6B-12 型智能消解仪内消解 10 min，消解 完成后先在空气中自然冷却 2 min，再向各消解管内 分别加入3 mL蒸馏水， 并再次在自来水中冷却2 min。 水冷结束后将消解管内各试液倒入特定比色皿中测 试样品的 COD 值。 1.3.3 辅酶 F420活性 取不同阶段发酵液各 10 mL 加入 50 mL 离心管 中， 并加入 10 mL 生理盐水搅拌稀释， 在 6 000 r/min 条件下离心 15 min。 收集沉淀物， 并再次加入 15 mL 生理盐水，同时在 95C 恒温水浴锅内水浴加热 30 min。冷却至室温后，向离心管内加入 25 mL 乙 醇溶液，并再次在 6 000 r/min 条件下离心 15 min。 离心后取上部清液，并用 4 mol/L 氢氧化钠溶液调 节上部清液 pH 值至 13.5，之后再在 8 000 r/min 条 件下离心 15 min，并将离心后的上部清液等体积分 成 2 份。 其中一份用 6 mol/L 的盐酸溶液调节 pH 值 略低于 3.0，并记录盐酸使用量，另一份加入与盐酸 相同体积的蒸馏水作为参照对比样。使用紫外可见 分光光度计测试上述2份试液在波长 420 nm处的吸 光度值，并按照式1计算辅酶 F420的活性。 Af C sL  1 式中C 为辅酶 F420浓度，μmol/L；A 为 pH＜3 的 样品溶液做参照，pH13.5 的试液在 420 nm 的吸光 度值； f 为稀释倍数25 倍； L 为比色皿厚度1.3 cm； s 为 F420在 pH13.5 时的毫摩尔消光系数54.3。 1.3.4 其他指标 实验组与对照组发酵液离心后取上部清液，并 用蒸馏水稀释 10 倍。使用 UV-5200 紫外可见分光 光度计测试上部清液稀释后在 254 nm 处吸光度值 UV254，用来代替 TOC总有机碳含量。采用 FEI Quanta FEG 250 场发射扫描电子显微镜SEM观察 产气前后煤表面变化特征。 2 结果与讨论 2.1 产气量 实验组与对照组产气量结果如图 2 所示。由 图 2 可以发现，两者产气量均大致呈现先上升后 下降的变化趋势，且总产气量分别是 2 322.0 mL 与 1 330.2 mL。① 实验组在反应第 1 天开始产 气122.0 mL，最大值出现在第 3 天294.0 mL，占 总产气量的 12.66。4 d 之后产气量开始逐渐下降， 最终维持在 67.67 mL。 ② 对照组初始产气时间晚于 实验组第 5 天，且出现两个明显的产气峰值。这是 因为白腐真菌能够有效降解煤中的木质素[18-19]，继而 缩短了产甲烷过程的水解持续时间。1116 d，产气 量由 44 mL 增加到 294 mL。 16 d 之后产气量开始下 降，最终定格在 32 mL，远小于实验组。 图 2 实验组和对照组产气量变化特征 Fig.2 Changes in gas production of the EG and CG 2.2 化学需氧量 COD 与碳转化率 煤是一种微溶于水的大分子有机混合物，外源 菌的添加降解可使煤中脂肪烃、小分子芳香烃等可 溶性有机质增加。发酵液中有机质含量越多，化学 需氧量COD值越大。 实验组与对照组发酵液内COD ChaoXing 第 2 期 张怀文等 白腐真菌预处理对煤厌氧发酵产甲烷的影响 123 值如图 3 所示。实验组与对照组 COD 分别为 32.34176.00 mg/L 与 576609 mg/L， 碳转化率分别 是 5.10与 4.70表 2。这说明实验组的降解转化 过程更为彻底， 更多的有机质被转化生成 CH4、 CO2 等目标产物，而不是残留在发酵液内。 产气前由于未对白腐真菌做进一步分离处理， 使得实验组前 3 d 发酵液内有机质降解量大于生成 量，COD 值由 65.02 mg/L 降至 32.34 mg/L 图 3。 随后实验组水解和产酸阶段39 d生成的氨基酸 类、酯类、酸醇类等小分子有机质使得 COD 值由 32.34 mg/L 增加到 137.13 mg/L。1221 d，产甲烷 菌利用乙酸、甲基类等有机质生成 CH4与 CO2， 同时酸毒性有机质开始逐步积累，使得 COD 值71.412176.0066.3297.47 mg/L呈先增加后 降低再增加的浮动特征。 对照组 COD 值变化与实 验组基本相似，但拐点出现时间略有差异，这与两 者反应体系内微生物多样性和菌群间竞争强度密切 相关。 图 3 实验组与对照组化学需氧量 COD Fig.3 The mass concentration of COD 表 2 产气前后碳含量变化 Table 2 Changes in carbon element 碳质量分数 ω/ 组别 产气前 产气后 碳转化率/ 实验组 76.24 72.35 5.10 对照组 76.24 72.66 4.70 2.3 辅酶 F420活性 研究证实， 单位比色皿在 254 nm 波长光程下紫 外线吸收度 UV254与 TOC 相关度高，可以作为总有 机碳含量 TOC 的一种很好的替代参数[20]。 煤厌氧发 酵产甲烷是一系列生物化学的偶联反应，产甲烷菌 位于整条厌氧生物链最顶端，而辅酶 F420作为一种 产甲烷菌所特有的酶类，与产甲烷菌的活性有着不 可分割的联系，是产甲烷菌活性状态的反应指标之 一[21-22]。因此，采用紫外分光光度法测试，反映试 液内底物变化情况及产甲烷活性状态的 UV254大小 和辅酶 F420活性，测试结果如图 4 所示。 图 4 辅酶 F420与 UV254变化 Fig.4 The variation characteristics of coenzyme F420 and UV254 一般来说，产酸细菌生长速率较快，世代时 间微生物每繁殖一代所需要的时间为 1030 min， 而 产甲烷菌生长非常缓慢，其世代时间一般在 46 d[23]。 实验组煤样经预处理后，其孔隙连通性增强，孔径 增大， 为微生物提供了更多的吸附位和降解点[24-25]。 从开始接种到培养第 3 天，产甲烷菌的世代时间还 未完成，数量较少，但产酸细菌的世代时间早已完 成，数量较多，并对煤进行了部分降解，使发酵液 内生成了乙酸、丙酸、丁酸等酸性有机物。但丙酸、 丁酸等酸性有机物无法被产甲烷菌直接利用，导致 发酵液内总有机碳的生成速率高于降解速率。 因此， 实验组 UV254值升至 0.026 43 cm，辅酶 F420活性降 至 0.005 03 μmol/L图 4a。随着产甲烷菌世代时间 的完成，辅酶 F420活性增长迅速，在第 6 天时达到 最大活性值 0.011 72 μmol/L，同时有机碳开始被 大量消耗，在第 6 天时含量出现最低值，UV254 为 0.021 81 cm。之后产甲烷菌的活性由于酸性有 机物的过度积累而受到抑制，由最大值降至最小 值0.003 65 μmol/L，有机碳含量开始逐步增加， UV254最终维持在 0.03 cm 附近。 在反应前 6 d， 对照组发酵液内用于满足菌体繁 殖代谢及细胞活动所需能量的有机碳源酵母膏优先 ChaoXing 124 煤田地质与勘探 第 48 卷 被消耗， 致使发酵液内有机碳不断减少，UV254降低 至 0.008 09 cm图 4b，而产酸细菌与产甲烷菌在生 长速率的差异性，使发酵细菌、产氢产乙酸菌产生 的酸抑制了辅酶 F420活性[26-27]，导致其在第 36 天 增长较为缓慢。之后水解和产酸阶段生成的酸性物 质与煤中碳源被其有效利用，辅酶 F420活性增长迅 速，在第 9 天时达到最大活性值 0.007 97 μmol/L， 而细菌代谢所生成的大量含碳有机物也直接导致了 接种液内有机碳的快速增加。918 d，有效碳源的 减少影响并降低了辅酶 F420的活性，使其降低至最 小值 0.003 47 μmol/L。18 d 之后，对照组与实验组 中，辅酶 F420活性的增加可能与产甲烷菌群的迁移 和本身生理状态的调整、煤孔隙结构的变化相关， 仍需进一步研究证实。 2.4 SEM 分析 实验组与对照组产气前后扫描电镜图片如图 5 所示。 图 5 实验组与对照组产气前后煤显微结构变化特征 Fig.5 Changes in coal micro structure of EG and CG before and after gas production 由图 5 可以发现，实验组在产气前预处理结束 后煤表面更加粗糙，且表面微生物吸附量也更多， 这为其后续产甲烷过程中水解期的缩短与总产气量 的增加提供了必要的物质基础。产气结束后煤表面 更加粗糙，且有菌簇的形成。与实验组相比，产气 前对照组煤表面相对光滑， 且微生物吸附量也较少。 产气结束后，对照组煤表面同样变得较为粗糙，但 粗糙度小于实验组。图 5 表明煤样在产气前后均发 生了不同程度的降解，并伴有菌群的迁移和吸附， 且白腐真菌预处理能够明显改善和提高煤中有机质 的有效降解。这与实验组具有高产气量、高碳转化 率、高辅酶活性的“三高”特征具有很好的吻合性。 3 结 论 a. 煤样经白腐真菌预处理后初始产气时间明 显提前，较对照组提前 4 d，总产气量和碳转化率也 明显增加。 b. 实验组降解更为彻底，实验组和对照组化学 需氧量 COD 分别是 32176 mg/L 与 576609 mg/L。 c. 辅酶 F420活性受 TOC 含量和产酸细菌的影 响，且实验组辅酶活性更高，降解过程也更为彻底。 d. 白腐真菌预处理为微生物在煤表面提高了 更多的吸附位点，煤表面更加粗糙，且产气结束后 有菌簇的形成。 请听作者语音介绍创新技术成果 等信息，欢迎与作者进行交流 参考文献References OSID 码 [1] 占迪，何环，廖远松，等. 褐煤强化产甲烷菌群的群落分析及 条件优化[J]. 微生物学报，2018，584684–698. 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