硝酸酸雾对拟南芥的毒性效应研究.pdf

硝酸酸雾对拟南芥的毒性效应研究 董轶茹 1 刘文丽 2 1. 山西省环境监测中心站， 太原 030027;2. 山西省环境监测中心直属站， 太原 230027 摘要 采用拟南芥植物检测技术， 考察了硝酸烟雾暴露条件下拟南芥生长状况及叶片中叶绿素含量、 活性氧代谢、 丙二 醛 MDA 和蛋白羰基 PCO 等几种指标的变化情况， 旨在为硝酸烟雾的生态毒理学效应研究提供试验依据。结果表 明， 硝酸烟雾可引起拟南芥叶片发黄萎蔫等病理反应， 时间依赖性地降低叶绿素含量和氧自由基产生速率， 并增加 MDA 和 PCO 含量， 提示硝酸烟雾可通过诱导氧化应激造成植物损伤。 关键词 硝酸烟雾; 拟南芥; 叶绿素; 活性氧; 丙二醛 MDA TOXICOLOGICAL EFFECT OF NITRIC ACID FOG ON ARABIDOPSIS THALIANA Dong Yiru1Liu Wenli2 1. Shanxi Environmental Monitoring Central Station，Taiyuan 030027，China; 2. Directly Affiliated Station，Shanxi Environmental Monitoring Center，Taiyuan 030027，China Abstract In the present study，the effect of nitric acid fog with different exposure time on the morphology and several physiological inds in Arabidopsis thaliana leaves were examined，to probe the possible eco-toxicological effects after its exposure． The results indicated that nitric acid fog could cause the morphological damage of the leaves in Arabidopsis thaliana， decrease the content of CHL and metabolism of reactive oxygen leachate，and also increase the level of MDA and PCO． The results suggested that nitric acid fog could rt damage to plant through inducing oxidative stress． Keywordsnitric acid fog;arabidopsis thaliana L． ;chlorophyll;reactive oxygen;MDA 0引言 酸雾 acid fog ， 通常是指雾状的酸类物质。酸 雾的排放会造成工作场所的空气中酸雾和酸性气体 弥漫， 排入大气后又会造成大气环境中的酸沉降。它 不仅危及工人及厂房周围居民的身体健康 ［1］， 腐蚀 厂房设备及精密仪器， 造成生产和生活的损失， 而且 还会 对 农 作 物 及 其 他 动 植 物 的 生 存 带 来 不 良 影响 ［2- 3］。 拟南芥是一种典型的模式植物， 被广泛应用于分 子生物学、 植物遗传学和发育生物学的研究当中， 由 于其具有植株形态个体小、 生长周期短、 种子多、 生命 力强、 取材方便、 易于培养和基因组小等优点而比其 他植物具有了无可比拟的特性。本课题通过研究模 式植物拟南芥对硝酸酸雾逆境胁迫的应激反应， 以期 为植物对硝酸酸雾的抗逆机制研究提供一定的实验 依据， 也为以后光化学烟雾中复合污染物对植物影响 的研究奠定一定的理论基础。 1实验部分 1. 1实验材料 拟南芥 Arabidopsis thaliana L． 为 Columbia 生 态型 Col- 0 来自中国农业科学研究院。用 1 次氯 酸钠将种子消毒， 采用蒸馏水清洗 3 次后再用蒸馏水 浸泡， 且于 4 ℃ 下春化 3 d。播种于上口径长、 宽均为 4. 5 cm， 下口径长、 宽均为 3 cm， 高为 4 cm 的育苗盘 中， 底部开有直径为 1 cm 的吸水孔， 每一个育苗盘种 植 5 株拟南芥。栽培所用营养土为德国进口育苗泥 炭土。植株培养条件为 白天为 22 1℃ ， 夜间为 18 1℃ ， 光照 /黑暗时间为 16 h/8 h， 光照强度大 于 3 000 lx， 相对湿度保持在 70 左右。 1. 2叶绿素含量测定 叶绿素含量的测定用分光光度法。分别称取对 照组和各处理组的新鲜叶片 0. 1 g， 置于研钵中， 加入 5 mL 蒸馏水， 再加入适量的石英砂及少许的碳酸钙， 均匀研磨匀浆后再用蒸馏水定容到 10 mL。吸取 031 环境工程 2013 年 2 月第 31 卷第 1 期 1. 5 mL匀浆液于大试管中， 加入 6 mL， 80 丙酮提取 叶绿素， 过滤后， 以 80 丙酮为空白对照， 用 1 cm 光 径的比色杯分别于 663， 645 nm 处测定吸光度值 ［4］。 1. 3活性氧代谢测定 氧自由基产生速率的测定用羟胺法。分别称取 对照组 和 各 处 理 组 的 新 鲜 叶 片 2 g， 加 入 2 mL， 50 mmol/L 的 pH 为 7. 8 的磷酸缓冲液， 充分研磨， 10 000 r/min离心 20 min， 上清液定容至 3 mL， 此液 即为氧自由基产生待测液， 取样品提取液 0. 5 mL， 加 入 0. 5 mL 的 50 mmol/L 磷 酸 缓 冲 液， 1. 5 mL 的 1 mmol/L盐酸羟胺， 摇匀后放入 25 ℃ 的水浴中保温 1 h， 分别给其中加入 2 mL 7 mmol/L 的 α-萘胺和 2 mL 17 mmol/L 的对氨基苯磺酸， 混匀后， 25 ℃ 保温 20 min， 取出在 530 nm 波长下， 用分光光度计测定吸 光度值， 标准母液用 NaNO2配制［5］。 1. 4MDA 含量测定 MDA 含量的测定用硫代巴比妥酸 TBA 反应 法。随机剪取多株植物上的叶片适量， 加入 5 三氯 乙酸 TCA 研 磨 至 匀 浆， 匀 浆 在 4 000 r/min 离 心 10 min， 吸取上清液， 加入 0. 6 硫代巴比妥酸 TBA 溶液， 摇匀 对照管吸取等体积蒸馏水 。将试管放 入沸水浴中煮沸， 即试管内溶液出现小气泡时开始计 时持 续 10 min，待 试 管 冷 却 后 3000 r/min 离 心 15 min， 取上清液分别在 532， 600， 645 nm 处测定吸 光度值， 以对照管为空白 ［6］。 1. 5PCO 含量测定 蛋白羰基的测定用 2， 4-二硝基苯肼法。蛋白提 取 剪取 0. 5 g 叶片， 在冰浴上用预冷的 0. 05 mol/L pH 为 7. 0 磷酸缓 冲液 2. 5 mL 研 磨， 将 匀 浆 液 以 10 000 r/min的转速， 于 4 ℃ 离心 5 min， 取 900 μL 上 清液， 加入 100 μL 10 的硫酸链霉素溶液于上述提 取的上 清 液中， 待 室 温 放 置 10 min 后， 于 4 ℃ 以 10 000 r/min的转速离心 15 min， 取上清液 去除核酸 干扰 。试 验 组 取 100 μL 上 清 液， 加 入 400 μL DNPH; 对照组取 100 μL 上清液， 加入 2 mol/L HCl 400 μL， 并立即于暗处遮光反应 1 h， 每 10 min 涡流 1 次。1 h 后 取 出， 加 入 500 μL 20TCA， 反 应 10 min。以10 000 r/min的转速， 于 4 ℃ 离心 15 min， 弃去上清液。用 1∶1 乙醇 乙酸乙酯共 1 mL 洗涤沉 淀两三次后加入 1. 2 mL 6mol/L 盐酸胍， 于 37 ℃ 水 浴 15 min， 促使溶解沉淀。以 10 000 r/min 的转速， 于 4 ℃ 离心 15 min， 在 370 nm 波长下进行比色 ［7］。 1. 6实验数据的统计分析 实验结果为对照平均值归一化处理后的相对值， 用 Mean SE 表示。对所得数据进行 one-way ANOVA 方差分析， 检测不同浓度处理组与对照组间的差异显 著性。与对照组相比， * P ＜ 0. 05， 表示呈现显著差 异; ＊ ＊P ＜0. 01， 差异极显著;＊ ＊ ＊P ＜0. 001， 差异极显著。 2结果分析 2. 1硝酸酸雾对拟南芥生长发育的影响 图 1 所示为不同暴露时间下硝酸酸雾对拟南芥 形态结构的影响 对照组拟南芥叶片饱满， 色泽鲜亮， 呈翠绿色; 硝酸酸雾暴露 4h/d 即出现急性危害， 表现 为叶片数目下降， 部分叶片色泽退绿发黄; 暴露 8h/d 拟南芥植株表现出更加明显的伤害， 大部分植株萎蔫 且叶片变黄， 干枯。以上结果说明硝酸酸雾对拟南芥 形态结构的影响具有时间依赖性。 图 1不同暴露时间下硝酸酸雾对拟南芥形态指标的影响 2. 2硝酸酸雾对拟南芥叶绿素和活性氧代谢的影响 图 2a 所示为不同暴露时间下硝酸酸雾对拟南芥 叶绿素的影响。由图可以看出 在酸雾暴露下， 叶绿 素含量随着暴露时间的增加显著下降， 与对照组相 比， 每天暴露 4 h 后即呈现出极显著差异 P ＜ 0. 01 ， 当暴露时间延长为 8 h， 叶绿素含量进一步下降， 与对 照组的统计学差异也进一步加大 P ＜ 0. 001 。 图 2b 所示为不同暴露时间下硝酸酸雾对拟南芥 活性氧代谢的影响。由图可以看出 拟南芥叶片中氧 自由基产生速率随着暴露时间的延长呈下降趋势， 4 h/d 和 8 h/d 两个处理组中氧自由基产生速率均低 于对照组， 分别为对照组的 0. 93 倍 P ＜ 0. 05 和 0. 56 倍 P ＜ 0. 001 。 图 2不同暴露时间下硝酸酸雾对拟南芥叶绿素和活性氧代谢的影响 131 环境工程 2013 年 2 月第 31 卷第 1 期 2. 3硝酸酸雾对拟南芥脂质过氧化和蛋白氧化损伤 的影响 由图 3a 可以看出 拟南芥叶片内 MDA 含量随着 暴露时间的延长， 呈现出时间依赖性增长趋势， 当暴 露于硝酸酸雾下 4 h/d 后， 拟南芥叶片内 MDA 含量 高于对照组， 但不具有统计学差异 P ＞ 0. 05 ; 当暴 露时间达 8 h/d 后， MDA 含量显著增加， 与对照组相 比， 呈极显著差异 P ＜ 0. 001 ， 为对照组的 1. 95 倍。 图 3b 所示为不同暴露时间下硝酸酸雾对拟南芥 叶片内 PCO 含量的影响。由图可以看出 当暴露于 硝酸酸雾下 4 h/d 后， 拟南芥叶片内 PCO 含量与对照 组相比， 无明显变化; 当暴露时间达 8 h/d 后， PCO 含 量显 著 增 加， 与 对 照 组 相 比， 呈 极 显 著 差 异 P ＜ 0. 001 ， 为对照组的 2. 34 倍。 图 3不同暴露时间下硝酸酸雾对拟南芥叶片内 MDA 和 PCO 的影响 3结论 根据观察拟南芥叶片形态的可见变化， 发现硝酸 烟雾可导致拟南芥叶片退绿发黄， 随着日暴露时间延 长， 还会出现萎蔫和枯死， 产生不可逆伤害， 最终死亡。 拟南芥叶片内叶绿素含量在暴露于不同时间的 硝酸烟雾后， 呈现出时间依赖性下降趋势， 提示硝酸 烟雾可破坏植物细胞色素系统， 从而导致拟南芥叶片 中叶绿素含量的降低。 随着硝酸烟雾日暴露时间的延长， 氧自由基产生 率含量呈现出显著降低趋势， 说明硝酸烟雾对拟南芥 产生了应激胁迫， 拟南芥叶片内抗氧化系统作用失 衡， 从而降低了氧自由基的产生速率。硝酸烟雾长时 间日暴露可引起拟南芥叶片中 MDA 和 PCO 的显著 积聚， 提示硝酸烟雾具有强氧化性， 可通过诱导氧化 应激造成植物细胞损伤， 乃至死亡， 最终表现为整体 的枯黄萎蔫和坏死。 参考文献 ［1］曾平． 不能忽视酸雾［J］． 环境保护，1983 4 10． ［2］Alscher R G，Erturk N，Herth L S． Role of superoxide dismutases SODsin controlling oxidative stress in plants［J］．Journal of Experimental Botany，2002，531331- 1341． ［3］Paolacci A R，Badiani M，D’ Annibale A，et al． Antioxidants and photo synthesis in the leaves of Triticum durum Desf．seedlings acclimated to non-stressing high temperature［J］． Journal of Plant Physiology，1997，150381- 387． ［4］朱广廉，钟海文，张爱琴． 植物生理学实验［M］． 北京 北京大 学出版社，1990． ［5］张志良，瞿伟菁． 植物生理学实验指导［M］． 北京 高等教育 出版社，2003． ［6］Beleid F I B，Pike S M，Novacky A J，et al． Lipid peroxidation and superoxide production in cowpea Vigna unguiculataleaves infected with tobacco ringspot virus or southern bean mosaic virus［J］ ． Physiological and Molecular Plant Pathology， 1993， 43， 109- 119． ［7］Levine R L，Garland D，Oliver C N，et al．Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins［J］． s in Enzymology，1990，186464- 478． 作者通信处董轶茹030027太原市兴华街 11 号山西省环境监测 中心站 E- maildyr_613 163． com 2012 － 09 － 11 櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅 收稿 上接第 125 页 ［8］Santona L，Castaldi P，Melis P． uation of the interaction mechanisms between red muds and heavy metals［J］． Journal of Hazardous Materials， 2006， 136 2 324- 329． ［9］Muller I， Pluquet E． Immobilization of heavy metals in sediment dredged from a seaport by iron bearing materials ［J］． Water Science and Technology， 1998， 37 379- 386． ［ 10］鲁如坤． 土壤农业化学分析方法［M］． 北京 中国农业科技出版 社， 2000． ［ 11］Tessier A，Campbell P GC，Bisson M． Sequential extraction procedure for the speciation of particulate trace metals［J］． Anal Chem， 1979， 51 844- 851． ［ 12］高国卫， 黄益宗， 雷鸣． 添加堆肥和赤泥对土壤生物有效性 Cd 和 Zn 的影响［J］． 环境工程学报， 2008， 2 1 79- 82． ［ 13］Lombi E， Zhao F J， Zhang G， et al． In situ fixation of metals in soils using bauxite residueChemical assessment［J］． Environmental Pollution， 2002， 118 3 435- 443． ［ 14］袁兴中， 曾光明． 土壤 － 植物系统中 Pb 的迁移转化影响因素研 究进展［J］． 安徽农业科学， 2008， 36 16 6953- 6955． ［ 15］高卫国， 黄益宗， 孙晋伟， 等． 赤泥和堆肥对土壤锌形态转化的 影响［J］． 农业环境科学学报， 2008， 27 3 879- 883． ［ 16］雷鸣， 廖柏寒， 秦普丰． 土壤重金属化学形态的生物可利用性评 价［J］． 生态环境， 2007， 16 5 1551- 1556． 作者通信处钟克师528143广东省佛山市三水区大塘工业园兴 唐路 10 号 佛山市三水佳利达纺织染有限公司 E- mailkeshi120 163． com 2012 － 04 － 13 收稿 231 环境工程 2013 年 2 月第 31 卷第 1 期