一株氯苯优势降解菌的降解条件优化.pdf

一株氯苯优势降解菌的降解条件优化 * 牛仙 1， 2 丁成 2 李朝霞 3 杨百忍 2 1． 江苏大学环境学院， 江苏 镇江 212013; 2． 盐城工学院环境科学与工程学院， 江苏 盐城 224051; 3． 盐城工学院化学与生物工程学院， 江苏 盐城 224051 摘要 以氯苯降解率为降解效果指标， 以降解温度、 初始 pH、 降解时间、 接种量和氯苯初始浓度为影响因素， 对实验室 保藏的一株氯苯优势降解菌株 Lysinibacillus fusiis LW13 降解氯苯的降解条件进行优化。单因素试验结果表明， 该 降解菌株对氯苯的适宜降解条件分别为 温度 20 ～ 40 ℃ ， pH 为 8. 0， 降解时间 4 d， 接种量 2 ～ 4 ， 氯苯初始浓度 60 ～ 140 mg/L。以降解温度、 氯苯初始浓度和接种量这三个显著影响因素进行正交试验， 结果表明各影响因素的主次 顺序为降解温度 ＞ 氯苯初始浓度 ＞ 接种量， 最佳降解条件为降解温度 35 ℃ 、 氯苯初始浓度 100 mg/L 和接种量 4 ， 最 佳降解条件下氯苯降解率可高达 93. 8 。 关键词 氯苯; 优势降解菌; 降解条件; 正交试验 DEGRADATION CONDITIONS OPTIMIZATION OF A DOMINATED CHLOROBENZENE DEGRADING STRAIN ON CHLOROBENZENE Niu Xian1， 2Ding Cheng2Li Zhaoxia3Yang Bairen2 1． School of Environment， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China; 2． School of Environmental Science and Engineering， Yancheng Institute of Technology， Yancheng 224051， China; 3． School of Chemical and Biological Engineering， Yancheng Institute of Technology， Yancheng 224051， China AbstractTaking the degradation rate of chlorobenzene as the effect indicator， the single factor experiments of the dominate degradation strain Lysinibacillus fusiis LW13 perseverated in our laboratory on chlorobenzene in different degradation conditions， such as the degradation temperature， initial pH， the degradation time， the inoculation of the strain， and the initial concentration of chlorobenzene， had been studied． It was showed that the suitable single factor degradation conditions were with degradation temperature of 20 ～ 40 ℃ ， pH 8. 0， degradation time of 4 h， inoculation of 2 ～ 4 ， and the initial chlorobenzene concentration of 60 ～ 140 mg/L．The further orthogonal experiment with three notable factors of the temperature， the initial concentration of chlorobenzene and the inoculation indicated that the effect order of strain LW13 on chlorobenzene was the degradation temperature ＞ the initial concentration of chlorobenzene ＞ the inoculation． The optimized degradation conditions were with temperature of 35 ℃ ， initial concentration of chlorobenzene of 100 mg/L， and inoculation of 4 ． Under these conditions， the degradation rate of chlorobenzene in the degradation reaction reached 93. 8 ． Keywordschlorobenzene;dominated degrading strain;degradation conditons;orthogonal experiment * 科技部科技型中小企业技术创新基金 09C26213203714 ; 江苏省环 保科 研 课 题 2012025 ;江 苏 省 新 型 环 保 重 点 实 验 室 开 放 课 题 AE201119 ; 2010 年度江苏省高校 “青蓝工程” 科技创新团队资助项目。 0引言 氯苯类化合物广泛应用于工业生产， 主要作为清 洗溶剂、 农药及染料合成中间体及在脱脂工艺中使 用 ［1］。研究表明 氯苯对海洋生物［2］、 人体健康［3］均 产生不良影响， 并且在土壤 ［4］、 植物［5］、 水源地［6］中 都有积累。当前， 除了传统的物化法工艺， 氯苯类化 合物的生物处理也受到更多学者关注。然而氯苯是 一种人工合成化合物， 属于环境外来物， 自然界微生 物缺乏降解此类化合物的酶或酶系统， 所以很难进行 生物处理， 因而研究氯苯类降解微生物是实现生物降 解的关键所在。 王灿 ［7］等将白腐真菌应用于生物过滤塔处理氯 苯废气， 在进口浓度 200 ～ 1 500 mg/m3， 空塔停留时 间为 122 s 的条件下， 氯苯的最大去除率接近 80 。 34 环境工程 2013 年 2 月第 31 卷第 1 期 戴青华 ［8］等从某污水处理曝气池的活性污泥中分离 出一株能够以 1， 4-二氯苯为唯一碳源和能源生长的 菌株 DEB- 1， 初 步 鉴 定 为 黄 杆 菌 属 Flavobacterium sp． ， 1， 4-二氯苯降解率最高达 94. 5 。本课题组对 降解氯苯类化合物微生物的分离与降解特性也做过 一系列研究 ［9- 11］， 本试验对实验室分离并保藏的一株 氯苯优势降解菌株 Lysinibacillus fusiis LW13 下 简称降解菌株 进行活化并扩大培养 ［12］， 在单因素试 验的基础上采用正交试验分析法 ［13］对该降解菌株降 解氯苯的降解条件进行了优化， 为今后该菌株的进一 步理论研究和应用实践提供依据。 1试验部分 1. 1材料 1. 1. 1菌株来源 溶藻菌 Lysinibacillus fusiis LW13 基因登录 号为 JN166076 分离自本实验室长期运行的生物滴 滤塔处理氯苯废气设备。 1. 1. 2培养基 无机盐培养基配方 ［12］ K 2HPO4 4. 35 g， KH2PO4 1. 7 g， NH4Cl 2. 1 g， MgSO40. 2 g， MnSO40. 05 g， FeSO4 7H2O 0. 01 g， CaCl2 2H2O 0. 03 g， 蒸馏水定容 至 1 L， 调节 pH 为 6. 8 ～ 7. 0。试验过程中在培养基 添加适量氯苯。 1. 1. 3主要仪器 TU- 1901 可见分光光度计 北京普析通用仪器有 限责任公司 ; GC580 气相色谱仪 美国 PerkinElmer Clarus ; SW-CJ-ID 单人超净工作台; SPJ 生化 培养 箱、 XMTD- 204 空气浴恒温培养振荡器、 WHY- 2 水浴 恒温培养振荡器。 1. 2方法 1. 2. 1氯苯降解条件优化 单因素试验 菌株通过活化及扩大培养后， 配制 成适宜浓度 108～ 109cfu/mL 的菌悬液。在不同的 单因素条件 降解温度、 初始 pH、 降解时间、 接种量和 氯苯初始浓度 下， 将菌悬液加入无机盐培养基中振 荡培养， 定期取样测定样液中的氯苯浓度。 正交试验 选择单因素试验中降解效果较好且影 响显著的降解条件， 进行多因素多水平正交试验， 以 确定该菌对氯苯的最佳降解条件组合和降解效果。 1. 2. 2氯苯测定 采用摇瓶顶空气相色谱法测定气相中氯苯浓度， 再结合氯苯的亨 利定律 常 数， 得 出 液 相 中 氯 苯 浓 度 ［14］。为克服测定期间氯苯挥发、 浓度变化等带来 的误差， 每个样液均设有空白对照液。空白对照液除 以蒸馏水代替菌悬液外， 其余处理与样液相同。 气相色谱条件 色谱柱为 Elite- 5 毛细管柱 30 m 0. 32 mm 0. 5 μm ; 柱子温度采用程序升温， 初温 70 ℃ ， 保留 1 min， 以 10 ℃ /min 升温至终温 110 ℃ ， 保留 1 min; 汽化室温度 200 ℃ ; 检测器 FID 温度 250 ℃ ; 柱流量 1. 5 mL/min，N2为载气， 不分流进样; 氢气流量 45 mL/min， 空气流量450 mL/min; 进样量 50 μL。 氯苯降解率 空白对照液氯苯浓度 － 样液氯 苯浓度 /空白对照液氯苯浓度。 2结果与讨论 2. 1降解温度对降解效果的影响 将菌悬液以 2 的接种量分别转入 50 mL 无机 盐培养基 pH7. 0 ， 加入初始浓度为 100 mg/L 的氯 苯， 置 于 不 同 温 度 20， 25， 30， 35， 40 ℃ 摇 床， 160 r/min摇床振荡培养 4 d， 分别测定氯苯浓度 见 图 1 。 图 1不同降解温度下的氯苯降解效果 由图 1 可知 温度对氯苯降解效果的影响较大。 在 20 ～ 40 ℃ 的温度范围内， 菌株都有较好的降解性 能， 说明该菌对环境的适应性较强。在20 ～ 35 ℃ 之 间， 菌株对氯苯的降解随温度的升高而不断增加。当 温度超过 35 ℃ 后， 降解率 开 始 下 降。因 此， 温 度 35 ℃ 左右为氯苯的最适降解温度。 2. 2初始 pH 对降解效果的影响 将菌悬液以 2 的接种量分别转入 50 mL 不同 初始 pH 4. 0、 5. 0、 6. 0、 7. 0、 8. 0、 9. 0、 10. 0 无机盐培 养基， 加入初始浓度为 100 mg/L 的氯苯， 160 r/min， 35 ℃ 条件下摇床振荡培养 4 d， 分别测定氯苯浓度 见图 2 。 由图 2 可知 菌株在降解氯苯的过程中受 pH 的 44 环境工程 2013 年 2 月第 31 卷第 1 期 图 2不同降解 pH 下的氯苯降解效果 影响较小。在初始 pH 5. 0 ～ 12. 0 时， 均能保持较高 的降解能力。并且氯苯的降解率随着初始 pH 的增 加具有一定的波动性， 但在总体上菌株适宜在弱碱性 环境下生长。由图 2 可知， 初始 pH 8. 0 为氯苯降解 的最适值。 2. 3降解时间对降解效果的影响 将菌悬液以 3 的接种量分别转入 50 mL 无机 盐培养基 初始 pH 8. 0 ， 加入初始浓度为 100 mg/L 氯苯， 160 r/min， 35 ℃ 条件下摇床振荡培养 4 d， 间隔 一定时间取样测定氯苯浓度 见图 3 。 图 3不同降解时间下的氯苯降解效果 由图 3 可知 降解时间对氯苯的降解影响较大， 前 72 h 内， 菌株对氯苯的降解率随降解时间的增大 而显著增加， 并且在前 20 h 内， 氯苯降解速率最快。 72 ～ 120 h 内， 氯苯的降解率增幅较小， 基本趋于稳 定。因此， 4 d 为氯苯降解的最适降解时间。 2. 4接种量对降解效果的影响 将菌悬液以 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 10 的接种 量分别转入 50 mL 无机盐培养基 初始 pH8. 0 ， 加 入初始浓度为 100 mg/L 氯苯， 于 160 r/min， 35 ℃ 条 件下摇床振荡培养 4 d， 间隔时间取样测定氯苯浓度 见图 4 。 图 4不同接种量下的氯苯降解效果 由图 4 可知 菌悬液接种量对氯苯的降解影响较 大， 当接种量为 2 ～ 4 时， 氯苯的降解曲线类似。 当菌悬液的接种量为 3 时， 氯苯的降解率最大。而 接种量为 1 、 5 时， 氯苯的降解率相对较低。当接 种量为 10 时， 由于接种量的增大， 停滞期变短， 因 而较快进入对数期， 前 6 h 内降解速率较快， 而后可 能由于营养条件的不足， 致使降解速率降低。因此， 接种量 3 左右为氯苯降解的最适接种量。 2. 5氯苯初始浓度对降解效果的影响 将菌悬液以 3 的接种量在无菌条件下转入初 始浓度为 60， 80， 100， 140， 180 mg/L 氯苯的 50 mL 无 机盐培养基 初始 pH8. 0 ， 于 160 r/min， 35 ℃ 条件 下摇床振荡培养， 间隔一定时间取样测定氯苯浓度 见图 5 。 图 5不同氯苯初始浓度下的氯苯降解效果 由图 5 可知 氯苯初始浓度的变化对菌株的降 解 性 能 有 一 定 影 响。 当 氯 苯 初 始 浓 度 为 60 ～ 140 mg/L时， 菌株对氯苯均能保持高于 85 的 降解率。在 4 d 的降解时间内， 当氯苯初始浓度为 100 mg/L时， 氯苯的降解率达到最大。而当氯苯初始 浓度为 180 mg/L 时， 培养 30 h 后， 菌株对氯苯的降 54 环境工程 2013 年 2 月第 31 卷第 1 期 解速率几乎不变， 说明氯苯的降解受到抑制。 2. 6正交试验条件优化 根据单因素试验结果可知， 相比初始 pH、 降解时 间而言， 温度、 氯苯初始浓度及接种量是影响氯苯降 解率的主要因素， 因此选择 L9 33 正交试验对氯苯 降解条件进行优化， 因素与水平设计如表 1 所示。 表 1正交试验表 试验号 A 降解 温度 /℃ B 氯苯初始浓度 / mgL － 1 C 接种 量 / 氯苯降 解率 / 11 301 801 287. 5 21 302 1002 389. 0 31 303 1203 490. 5 42 351 802 390. 8 52 352 1003 493. 8 62 353 1201 291. 6 73 401 803 488. 0 83 402 1001 292. 5 93 403 1202 391. 2 k18988. 890. 5 k292. 191. 890. 3 k390. 691. 190. 8 R3. 130. 5 由表 1 可知 降解温度、 氯苯初始浓度与接种量 的极差 R 分别为 3. 1， 3. 0， 0. 5。可见降解温度对氯 苯降解率的影响最大， 氯苯初始浓度也具有较大的影 响， 略低于降解温度， 而接种量的影响最小。极差分 析最佳组合为 A2B2C3， 并可以确定反应的最佳条件 为 降解温度 35 ℃ ， 氯苯初始浓度 100 mg/L， 接种量 4 ， 在此条件下氯苯的降解率最大， 达到 93. 8 。 3结论 利用微生物摇瓶试验法研究了菌悬液在不同降 解温度、 pH、 时间、 氯苯初始浓度及接种量对氯苯降 解率的影响。研究表明， 菌株对初始 pH 波动具有 较好的适应性， 降解温度为 20 ～ 40 ℃ 下也能保持 高于 80 的降解率， 说明该菌的冲击负荷抵抗力较 强， 实际工程应用中可能表现出一定优势。通过正 交试验分析法优化反应条件， 当降解温度 35 ℃ ， 氯 苯初始浓度 100 mg/L， 接种量 4 时达到 93. 8 的 降解率。 参考文献 ［1］Yadav J S， Wallace R E， Reddy C A． Mineralization of mono-and dichlorobenzenes andsimultaneous degradationofchloro- and methyl-substitued benzenes by the white rot fungus 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